比利时杜鹃花FLS基因、用于克隆该基因的引物组及其克隆方法和荧光定量引物组.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112662685A(43)申请公布日2021.04.16(21)申请号202110027872.7(22)申请日2021.01.11(71)申请人浙江万里学院地址315100浙江省宁波市鄞州区钱湖南路8号(72)发明人汪庆昊吴月燕(74)专利代理机构宁波奥圣专利代理有限公司33226代理人谢潇(51)Int.Cl.C12N15/53(2006.01)C12N15/11(2006.01)C12N15/10(2006.01)C12Q1/6895(2018.01)权利要求书1页说明书5页序列表2页附图2页(54)发明名称比利时杜鹃花FLS基因、用于克隆该基因的引物组及其克隆方法和荧光定量引物组(57)摘要本发明公开了比利时杜鹃花FLS基因、用于克隆该基因的引物组及其克隆方法和荧光定量引物组，该基因为黄酮醇合成酶基因RhFLS，其保守域的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，全长核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，编码区氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。本发明首次从比利时杜鹃花中克隆得到杜鹃花黄酮醇合成酶基因RhFLS，黄酮醇合成酶基因RhFLS为杜鹃花花色形成的关键基因之一，可以用于通过转基因等生物技术方法培育不同花色杜鹃花，为今后利用基因工程技术改良杜鹃花品质提供了重要的理论依据，具有广阔的应用前景和极大的经济价值。CN112662685ACN112662685A权利要求书1/1页1.比利时杜鹃花FLS基因，其特征在于，该基因为黄酮醇合成酶基因RhFLS，其保守域的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，全长核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，编码区氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。2.用于克隆比利时杜鹃花FLS基因的引物组，其特征在于，包括用于扩增SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的引物FLS‑F1、FLS‑R1、FLS‑F2和FLS‑R2，其序列分别为：FLS‑F1：GGAGAGCTACGCAAACGACC；FLS‑R1：TGGCAGCTAGAGGTTACGACTT；FLS‑F2：ACGACATTTGGCCCAAGAACCCT；FLS‑R2：GAGTACCGCCATCGCAAATTCAACA。3.比利时杜鹃花FLS基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)：比利时杜鹃花总RNA的提取和反转录；步骤(2)：比利时杜鹃花FLS基因保守域的核苷酸序列的扩增；步骤(3)：比利时杜鹃花FLS基因3'RACE和5'RACE的扩增；步骤(4)：PCR产物的克隆纯化与筛选。4.根据权利要求3所述的比利时杜鹃花FLS基因的克隆方法，其特征在于，步骤(2)的具体流程为：根据已知与杜鹃花属植物亲缘关系相近的植物物种的FLS基因的氨基酸及核苷酸序列，设计得到扩增比利时杜鹃花FLS基因保守域的核苷酸序列的引物FLS‑F1和FLS‑R1，以比利时杜鹃花苞的cDNA为模板，利用引物FLS‑F1和FLS‑R1进行PCR扩增反应，扩增得到比利时杜鹃花FLS基因保守域的核苷酸序列，即SEQIDNO.1。5.根据权利要求4所述的比利时杜鹃花FLS基因的克隆方法，其特征在于，PCR扩增反应的反应程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，25‑35Cycles；72℃、2min，结束。6.根据权利要求4所述的比利时杜鹃花FLS基因的克隆方法，其特征在于，所述的与杜鹃花属植物亲缘关系相近的植物物种为山茶、猕猴桃、锦绣杜鹃、杜仲和芍药。7.根据权利要求3所述的比利时杜鹃花FLS基因的克隆方法，其特征在于，步骤(3)的具体流程为：首先根据比利时杜鹃花FLS基因保守域的核苷酸序列，设计基因特异引物FLS‑F2和FLS‑R2，再以RACE5'/3'Kit提供的5'/3'RACEOuterPrimer和基因特异引物FLS‑F2和FLS‑R2为引物，并以比利时杜鹃花苞的cDNA为模板，进行5'/3'末端PCR扩增反应，扩增得到比利时杜鹃花FLS基因5'RACE和3'RACE，与步骤(2)中得到的比利时杜鹃花FLS基因保守域的核苷酸序列拼接，得到比利时杜鹃花FLS基因全长核苷酸序列，即SEQIDNO.2。8.根据权利要求7所述的比利时杜鹃花FLS基因的克隆方法，其特征在于，5'末端PCR扩增反应的反应程序为：94℃30s，72℃3min，5Cycles；94℃30s，70℃30s，72℃3min，5Cycles，结束；3'末端PCR扩增反应的反应程序为：94℃30s，68℃30s，72℃3min，30Cycles，结束。9.用于比利时杜鹃花FLS基因荧光定量PCR的RT‑PCR引物组，其特征在于，包括引物FLS‑F3和FLS‑R3，其序列分别为：FLS‑F3：TTGGTG