一种香腮杜鹃的遗传转化和再生体系建立的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110172476A(43)申请公布日2019.08.27(21)申请号201910376273.9(22)申请日2019.05.07(71)申请人元成环境股份有限公司地址310016浙江省杭州市江干区庆春东路2-6号1501室(72)发明人裴翠明张露周艳丽饶华珏张雪君田伟章成君(74)专利代理机构北京国翰知识产权代理事务所(普通合伙)11696代理人吕彩霞(51)Int.Cl.C12N15/84(2006.01)A01H4/00(2006.01)权利要求书1页说明书7页附图3页(54)发明名称一种香腮杜鹃的遗传转化和再生体系建立的方法(57)摘要本发明提供一种适用于香腮杜鹃遗传转化和再生体系建立的方法，属于生物技术领域，其遗传转化方法包括：种子预处理后暗培养2-6d；超声波处理20-40min；将农杆菌转化，活化；农杆菌侵染20-60min后共培养；脱菌；萌发培养、筛选培养、生根培养。其再生体系建立的方法包含：无菌苗培养；在添加卵磷脂的培养基中诱导愈伤组织并进行愈伤组织增殖培养；分化培养、壮苗培养、生根培养。本发明一种香腮杜鹃遗传转化的方法高效、稳定、简便、快速，利用分子调控机制建立的香腮杜鹃的再生体系更加高效，精确。CN110172476ACN110172476A权利要求书1/1页1.一种香腮杜鹃遗传转化的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)种子预处理后黑暗预培养2-6天；2)超声波处理；3)农杆菌转化，重组体为pCAMBIA3301重组质粒，含有卡那霉素抗性基因nptⅡ、报告基因GusA和外源目的基因Bar；4)农杆菌活化培养、侵染与共培养；5)脱菌清洗；6)萌发培养、筛选培养、生根培养。2.根据权利要求1所述的香腮杜鹃遗传转化的方法，其特征在于：所述超声波处理时间为20-40min。3.根据权利要求2所述的香腮杜鹃遗传转化的方法，其特征在于：所述农杆菌的侵染时间为20-60min。4.根据权利要求1或2所述的香腮杜鹃遗传转化的方法，其特征在于：所述农杆菌包括但不限于LBA4404。5.根据权利要求1或2所述的香腮杜鹃遗传转化的方法，其特征在于：所述萌发培养的培养基中添加400-500mg/L头孢霉素。6.根据权利要求1或2所述的香腮杜鹃遗传转化的方法，其特征在于：所述共培养的培养基中添加500-1200mg/L的蚕蛹粉。7.根据权利要求1或2所述的香腮杜鹃遗传转化的方法，其特征在于：所述共培养的培养基中添加20-30mg/L乙酰丁香酮。8.一种香腮杜鹃的再生体系建立的方法，其特征在于：1)无菌苗培养；2)诱导愈伤组织，在27.6-43.5mg/L的卵磷脂的培养基中进行诱导；3)愈伤组织增殖培养，在33.3-51.7mg/L的卵磷脂的培养基中进行增殖培养；4)分化培养、壮苗培养、生根培养。9.根据权利要求8所述的香腮杜鹃的再生体系建立的方法，其特征在于：所述生根培养的培养基中添加0.2-0.6mg/LNAA。10.根据权利要求8或9所述的香腮杜鹃的再生体系建立的方法，其特征在于：所述生根培养的培养基中添加2-4g/L活性炭。2CN110172476A说明书1/7页一种香腮杜鹃的遗传转化和再生体系建立的方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，进一步，涉及一种适用于香腮杜鹃的遗传转化和再生体系建立的方法。背景技术[0002]杜鹃花属(RhododendronL.)，灌木或乔木，有时矮小成垫状，地坐或附生；植株无毛或被各式毛被或被鳞片。叶常绿或落叶、半落叶，互生，全缘，稀有不明显的小齿。花芽被多数形态大小有变异的芽鳞。杜鹃属中不同种类，具有较为广泛的观赏价值、园艺价值和药用价值。中国花卉协会杜鹃花分会统计显示，截至2008年底，我国国内有17个城市以杜鹃花为市花，杜鹃花的年宵花、盆栽杜鹃以及绿化杜鹃已经形成为较大的产业，杜鹃花生产面积已经超过2500公顷。然而，尽管我国野生杜鹃种类繁多，但应用于生产的杜鹃新品种，大多来自于国外，我国的杜鹃花新品种选育工作迫在眉睫。[0003]植物基因工程自20世纪80年代诞生以来，转化技术和转化用的基因功能研究工作均取得了巨大进展。目前广泛应用的植物转基因方法包括基因枪法、农杆菌介导法、电击法等，均已取得成功。然而，这些方法均存在重复性差、转化周期冗长、整合频率低等缺点。为了克服这些难题，科学家们进行了不懈努力，研发了新的技术和方法，包括花粉管通道法、真空渗透法、胚型组织浸染法及农杆菌介导植物萌发种子法等，这些方法均不依赖于植物细胞组织培养的转化系统，具有操作简单、转化周期短等优点，使得转化研究更加便捷。[0004]本发明采用农杆菌介导植物萌发种子法实现香腮杜鹃的遗传转化，在避免组织培养的基础上，加快了种子的