一种快速建立葡萄遗传转化再生体系的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利(10)授权公告号(10)授权公告号CNCN103444524103444524B(45)授权公告日2014.10.29(21)申请号201310031683.2张丽等.农杆菌介导的葡萄转化研究进(22)申请日2013.01.08展.《生物技术通报》.2012,(第2期),14-19.鲍雪珍等.葡萄胚性愈伤组织无性系的建(73)专利权人河南省农业科学院烟草研究所立、保持及其植株再生的研究.《山东大学学报（自地址461000河南省许昌市青梅路与永昌路然科学版）》.1995,第30卷(第1期),105-111.交叉口邓杰等.农杆菌介导霞多丽葡萄胚性细胞系(72)发明人赵凤霞高相彬宋国华王正平遗传转化条件的优化.《果树学报》.2008,第25宋学立朱景伟卷(第2期),236-239.(51)Int.Cl.审查员马越C12N15/82(2006.01)A01H4/00(2006.01)(56)对比文件CN1273506A,2000.11.15,全文.CN101857875A,2010.10.13,全文.赵凤霞等.农杆菌介导的葡萄胚性与非胚性愈伤组织遗传转化过程中胁迫响应基因的表达.《果树学报》.2011,第28卷(第6期),964-971.权权利要求书2页利要求书2页说明书6页说明书6页附图2页附图2页(54)发明名称一种快速建立葡萄遗传转化再生体系的方法(57)摘要本发明为一种快速建立酿酒葡萄雷司令遗传转化再生体系的方法，属于葡萄转基因育种技术领域。其特征是，利用组织培养诱导葡萄花药获得的愈伤组织，经继代培养筛选获得胚性愈伤组织，以所获得胚性愈伤组织作为受体，通过根癌农杆菌介导的方法，利用选择培养基筛选获得抗性愈伤组织，再生葡萄植株。通过PCR验证和体视荧光显微镜观察报告基因gfp表达与否，快速鉴定转化体，提高葡萄转基因效率。与已有技术相比，使用本发明培养基培育筛选效果好，可以快速进行雷司令转基因葡萄植株的再生，大幅度提高葡萄转基因效率，再生率达到81％，转化周期短，在7个月内即可以获得转基因植株，转化体大幅度增加，转化率可以达到63％。CN103444524BCN103452BCN103444524B权利要求书1/2页1.一种快速建立葡萄遗传转化再生体系的方法，其特征在于：利用组织培养诱导葡萄品种雷司令花药获得的愈伤组织，经继代培养筛选获得胚性愈伤组织，以所获得胚性愈伤组织作为受体，通过根癌农杆菌介导的方法，利用选择培养基筛选获得抗性愈伤组织，再生葡萄植株，经分子检测及体式荧光显微镜观察，获得转基因葡萄苗；所述方法按照以下步骤进行：(1)根癌农杆菌活化：含有绿色荧光蛋白基因gfp的根癌农杆菌菌株在LB固体培养基上培养，挑取单菌落进行PCR验证，阳性表达的菌斑加入到抗性诱导培养基中，28℃，250rpm培养至OD600＝1.0，将菌液5000rpm离心10分钟，弃上清，加入液体共培养培养基重悬，用作农杆菌悬浮侵染液，所述抗性诱导培养基配方为：5g·L-1牛肉浸膏、1g·L-1酵母-1-1-1-1膏、5g·L蛋白胨、5g·L蔗糖、4g·LMgSO4·7H2O、100μmol·L乙酰丁香酮、50mg·L-1卡那霉素、50mg·L-1利福平，调节pH为5.2，所述液体共培养培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg·L-1盐酸硫胺素、0.2mg·L-1盐酸吡哆醇、0.5mg·L-1烟酸、150mg·L-1肌醇、50mg·L-1水解酪蛋白、10g·L-1椰乳、5％蔗糖、100μmol·L-1乙酰丁香酮、1mg·L-1奈氧乙酸、90g·L-1甘露糖醇，pH为5.2；(2)取继代培养后20天、生长状态良好的葡萄胚性愈伤组织，放入制备好的农杆菌悬浮侵染液，侵染20分钟，过程中间每隔5分钟摇动培养皿一次，然后倒出菌液，用灭过菌的吸水纸吸干愈伤组织表面菌液，转入固体共培养基中，28℃黑暗条件下倒置培养；三天后使用液体继代培养基清洗，所述固体共培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg·L-1盐酸硫胺素、0.2mg·L-1盐酸吡哆醇、0.5mg·L-1烟酸、150mg·L-1肌醇、50mg·L-1水解酪蛋白、10g·L-1椰乳、5％蔗糖、100μmol·L-1乙酰丁香酮、1mg·L-1NOA和0.28％脱乙酰吉兰糖胶；所述液体继代培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg·L-1盐酸硫胺素、0.2mg·L-1盐酸吡哆醇、0.5mg·L-1烟酸、150mg·L-1肌醇、50mg·L-1水解酪蛋白、10g·L-1椰乳、5％蔗糖、100μmol·L-1乙酰丁香酮、1mg·L-1NOA、1g·L-1头孢霉素和100mg·L-1二硫苏糖醇；(3)抗性愈伤组织