假单胞菌低温启动子及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102533769A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102533769A(43)申请公布日2012.07.04(21)申请号201210047244.6(22)申请日2012.02.28(71)申请人昆明理工大学地址650093云南省昆明市五华区学府路253号(72)发明人张琦冯强魏云林季秀玲林连兵杨光富(51)Int.Cl.C12N15/113(2010.01)C12N15/70(2006.01)C12N15/74(2006.01)C12N15/78(2006.01)C12N1/21(2006.01)C12R1/38(2006.01)权利要求书权利要求书11页页说明书说明书55页页序列表序列表11页页附图附图22页页(54)发明名称假单胞菌低温启动子及其应用(57)摘要本发明公开了一种假单胞菌低温启动子及其应用，具体涉及一种分离自云南梅里雪山明永冰川的耐低温假单胞菌Pseudomonassp.MY1402的低温启动子的序列及应用，本发明采用构建启动子探针质粒和建基因组文库的方法筛选，含有该启动子片段的重组质粒可以在原核细胞中、在低温下启动目标基因的表达；该启动子在不同原核生物中具有通用性，可用于构建在低温下多个原核生物之间能够通用的表达载体，以省却在不同原核生物中表达外源基因需要更换载体的麻烦，提高分子生物学实验效率；该启动子还能够用于在低温下启动低温蛋白和低温酶基因的表达，提高低温蛋白和低温酶的生产效率。CN10253769ACN102533769A权利要求书1/1页1.一种DNA分子，来源于低温假单胞菌，并具有下列核苷酸序列之一：a、具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；b、可与SEQIDNO.1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；c、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加、修饰的核苷酸序列；d、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于：该DNA分子具有启动子活性。3.一种含有权利要求1或2所述DNA分子的原核表达载体。4.一种原核宿主细胞，所述宿主细胞含有权利要求1或2所述的DNA分子或权利要求3所述的表达载体。5.权利要求1或2所述DNA分子在原核异源表达系统中的应用。6.根据权利5所述DNA分子在原核异源表达系统中的应用，其特征在于：原核异源表达系统为常温表达系统或低温表达系统。2CN102533769A说明书1/5页假单胞菌低温启动子及其应用技术领域[0001]本发明属于分子生物学领域，具体地涉及一个来源于低温假单胞菌启动子及其原核表达载体和应用。背景技术[0002]启动子是基因的一个组成部分，通常位于结构基因5’端上游，是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。启动子能够指导RNA聚合酶同模板正确结合，活化RNA聚合酶，启动基因转录，从而控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。在微生物的异源蛋白表达中，启动子是影响异源表达效率的重要因素之一，选择高效率的启动子是高效率表达外源基因的关键。[0003]当前，由于尚缺乏低温蛋白的高效表达系统，使得低温蛋白尤其是低温酶的生产远远不能满足科学研究及工业应用的需要。目前常用的蛋白表达系统多以大肠杆菌和酵母菌等中温菌作为宿主细胞，但由于大部分的低温酶热稳定性差，即使在中温宿主细胞中大量表达，也常会因热变性而失活。因此以嗜冷菌为宿主菌、以嗜冷菌启动子为启动子构建表达载体的方法越来越引起人们的重视。[0004]低温启动子的研究属于刚刚起步阶段，目前仅有Duilio等人从分离自南极的海洋低温假交替单胞菌属菌株PseudoalteromonashaloplanktisTAC125中，通过构建文库的方式，利用启动子探针质粒(PseudoalteromonashaloplanktisTAC125为宿主细胞)，筛选到了能在4℃启动转录的低温启动子。对这些启动子的结构和功能的解析，为我们认识低温启动子在低温下启动的机制提供了生动的材料。[0005]但是由于低温启动子的发展才刚刚起步，文献及资料相对较少，在当前还未形成完整的体系和理论。低温启动子在结构上不能与常温启动子明显区分开。一些具有低温启动活性的低温启动子的各功能调控区与常温启动子相同或相似。而还有一些具有低温启动活性的低温启动子则没有明显的保守结构序列，无法以常温启动子的保守序列为标准去确定其10区、35区等低温启动子特定的各功能区及保守结构序列。因此大量分离低温启动子并分析其序列已成为当务之急。[0006]此外，以低温菌为宿主细胞、利用来源于低温菌的启动子构建低温蛋白表达系统最近已有部分报道，研究表明在常温蛋白表达系统所难以表达的蛋白，包括来源于常温菌的甲苯、二甲苯单加氧