芹菜成分的环介导等温扩增引物、试剂盒及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103484456103484456A(43)申请公布日2014.01.01(21)申请号201310437148.7(22)申请日2013.09.23(71)申请人曹际娟地址116001辽宁省大连市中山区长江东路60号1808室申请人徐君怡曹冬梅孙铭英(72)发明人曹际娟徐君怡曹冬梅孙铭英(51)Int.Cl.C12N15/11(2006.01)C12Q1/68(2006.01)权利要求书1页权利要求书1页说明书8页说明书8页序列表2页序列表2页附图5页附图5页(54)发明名称芹菜成分的环介导等温扩增引物、试剂盒及其应用(57)摘要本发明公开芹菜成分环介导等温扩增引物、试剂盒及检测方法，其碱基序列如SEQIDNO.1～4；采用LAMP检测技术，建立了适用于食品中芹菜成分特异性检测的方法，本发明所述方法操作简单，不依赖昂贵仪器，检测时间在1小时左右，方法灵敏度达到0.5%，检测效率达到传统PCR方法或荧光定量PCR方法，能够应用于检验检疫实际工作，尤其适用于大量样品快速初筛和各种基层实验室食品品质监控，适合作为行业推荐性标准应用推广。CN103484456ACN1034856ACN103484456A权利要求书1/1页1.一种检测芹菜成分的环介导等温扩增引物，其特征在于，碱基序列为SEQIDNO.1～4。2.一种检测芹菜成分的环介导等温扩增法检测试剂盒，其特征在于，包括检测引物：SEQIDNO.1～4。3.根据权利要求2所述的检测芹菜成分的环介导等温扩增法检测试剂盒，其特征在于，在检测试剂盒中：每25μL的LAMP反应体系包括：SEQIDNO：3～4各1.6μM，SEQIDNO：1～2各0.2μM，20mMpH8.8的Tris-HCl，10mMKCl，6mMMgSO4，10mM(NH4)2SO4，0.1%Tween20，1M甜菜碱，1.6mMdNTP，8UBst大片断DNA聚合酶，0.5μlSYTO-9，2μlDNA模板。4.利用权利要求2所述试剂盒检测芹菜成分的方法，其特征在于，检测步骤包括：①提取待测样品的基因组DNA；②以步骤①提取的DNA作为模板，利用环介导等温扩增法检测：每25μL的LAMP反应体系包括：SEQIDNO：3～4各1.6μM，SEQIDNO：1～2各0.2μM，20mMpH8.8的Tris-HCl，10mMKCl，6mMMgSO4，10mM(NH4)2SO4，0.1%Tween20，1M甜菜碱，1.6mMdNTP，8UBst大片断DNA聚合酶，0.5μlSYTO-9，2μlDNA模板、蒸馏水：余量；反应条件为：保温阶段为63℃30s，1个循环；循环阶段为63℃15s，63℃45s，45个循环。5.如权利要求1所述的环介导等温扩增引物在检测芹菜成分方面的应用。2CN103484456A说明书1/8页芹菜成分的环介导等温扩增引物、试剂盒及其应用技术领域[0001]本发明属于食品检验技术方法领域，具体涉及一种芹菜成分环介导等温扩增（LAMP）引物、试剂盒及检测方法。背景技术[0002]食物过敏医学上也称变态反应，是指机体受抗原(包括半抗原)刺激后，产生相应的抗体或致敏淋巴细胞，当再次接触同一种抗原后在体内引起体液或细胞免疫反应，由此导致组织损伤或机体生理机能障碍。它是一种复发率很高的疾病，引起变态反应的抗原被称为变应原，又名致敏原。食品成分中存在的天然致敏原成分会引起6％至8%的儿童和2%的成人的过敏反应，严重的会危及生命。预包装食品由于多是成分复杂的深加工产品，如果含有致敏原成分而又未能明确告之，就有可能引起过敏，危害消费者的健康安全。目前大约有160多种食品致敏原，芹菜为常见的致敏原之一。2003年以来，欧盟、美国、香港等发达国家和地区相继制定了预包装食品致敏原标识要求的法规，并已于2005年起陆续发布和实施，对我国食品出口贸易造成了明显影响。由于目前我国在食品致敏原成分检测方法领域技术薄弱，随着越来越多国家和地区对食品致敏原成分标识法规的全面实施，食品标签的致敏原成分标识要求和符合性检验将会成为我国食品出口贸易的重要障碍。[0003]芹菜：拉丁学名Apiumgraveolens，属伞形科（Umbelliferae）芹属（ApiumL.）植物。芹菜主要有水芹、旱芹两种。[0004]目前，致敏原成分检测方法主要有酶联免疫法、聚合酶链式反应法、色谱质谱法、表面等离子共振免疫法等。但是不同的方法的检测限存在较大的区别，因此机构之间、国家之间应该采用一种检测结果较为精确、重复性较好的标准方法。目前较多国家所认可的方法是酶联免疫法。但是酶联免疫法也受许多因素制约，如被测食品母体、检测人员、试剂盒等。[0005]随着分