一种梅花鹿鹿茸与鹿角的鉴别方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107121485A(43)申请公布日2017.09.01(21)申请号201710316859.7(22)申请日2017.05.08(71)申请人中国农业科学院特产研究所地址130112吉林省长春市净月经济开发区聚业大街4899号(72)发明人张然然邢秀梅刘华淼(74)专利代理机构哈尔滨市文洋专利代理事务所(普通合伙)23210代理人王玉霞(51)Int.Cl.G01N27/62(2006.01)权利要求书1页说明书4页(54)发明名称一种梅花鹿鹿茸与鹿角的鉴别方法(57)摘要本发明涉及一种梅花鹿鹿茸与鹿角的鉴别方法，梅花鹿鹿茸与鹿角的鉴别方法为：检测待鉴定材料中是否存在肽聚糖识别蛋白1；含肽聚糖识别蛋白1的为鹿角，不含肽聚糖识别蛋白1的为梅花鹿鹿茸；肽聚糖识别蛋白1的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。本发明对梅花鹿鹿茸与鹿角的蛋白质进行提取，利用蛋白质组学研究技术Label-free方法检测蛋白质组分，获取梅花鹿鹿茸与鹿角的蛋白质表达谱，其中肽聚糖识别蛋白1只在鹿角组织中鉴定到，而在鹿茸组织中不能鉴定到肽聚糖识别蛋白1的存在。CN107121485ACN107121485A权利要求书1/1页1.一种梅花鹿鹿茸与鹿角的鉴别方法，其特征在于，梅花鹿鹿茸与鹿角的鉴别方法为：检测待鉴定材料中是否存在肽聚糖识别蛋白1；含肽聚糖识别蛋白1的为鹿角，不含肽聚糖识别蛋白1的为梅花鹿鹿茸；肽聚糖识别蛋白1的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。2.根据权利要求1所述的梅花鹿鹿茸与鹿角的鉴别方法，其特征在于梅花鹿鹿茸与鹿角的鉴别按以下步骤进行：步骤一、研磨离心取待鉴定材料加入液氮研磨成粉末后加入蛋白裂解液漩涡震荡，再置于冰上裂解，之后离心；步骤二、酶解取步骤一离心上清液加入二硫苏糖醇并37℃保温1h，然后在室温下冷却至室温再加入碘乙酰胺，避光下反应，再加入胰蛋白酶，反应14～24h后再加三氟乙酸(TFA)以终止酶解反应，真空干燥后得到待测粉末；步骤三、肽段分析利用质谱仪对待测粉末的蛋白质肽段进行分离和质谱鉴定，得到质谱数据；步骤四、蛋白质鉴定利用软件对所得质谱数据进行生物信息学分析，检测待鉴定材料中是否存在肽聚糖识别蛋白1，如存在肽聚糖识别蛋白1，则待测材料中含有鹿角成分。3.根据权利要求2所述的梅花鹿鹿茸与鹿角的鉴别方法，其特征在于，所述步骤一中，蛋白裂解液包括5mol/L的尿素(Urea)、2.5mol/L的硫脲(Thiourea)、0.04mol/L的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)、0.035mol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris-Base)、0.04mol/L的二硫苏糖醇(DTT)和两性载体(Bio-Lyte)；待鉴定材料与蛋白裂解液的比例为0.15g：500ul。4.根据权利要求2所述的梅花鹿鹿茸与鹿角的鉴别方法，其特征在于，所述步骤二中，胰蛋白酶与总蛋白质的质量比例为1:50，二硫苏糖醇(DTT)的终浓度为0.01mol/L，碘乙酰胺的终浓度为0.05mol/L，三氟乙酸(TFA)的浓度为0.5％。5.根据权利要求2所述的梅花鹿鹿茸与鹿角的鉴别方法，其特征在于，所述步骤三中，质谱仪中的流动相A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸的乙腈溶液；检测开始后，前1min内，B液线性梯度从3％到8％；2～80min内，B液线性梯度从8％到40％；81～110min内，B液线性梯度从40％到85％；最后两分钟B液线性梯度维持在85％，质谱采用正离子模式，喷雾电压为1.85kV、扫描范围：m/z300-2000。6.根据权利要求2所述的梅花鹿鹿茸与鹿角的鉴别方法，其特征在于，所述步骤四中，先对质谱数据进行从头测序计算，然后再进行数据库搜索，参数设置方式如下：固定修饰为Carbamidomethylation；可变修饰为Oxidation；酶切蛋白为胰蛋白酶；肽段末端不允许有非特异性断裂；母离子质量数最大容许误差范围为±20.0ppm，碎片离子最大容许误差范围为0.5Da；数据库为NCBI非冗余蛋白质数据库(物种为反刍动物)；FDR值<1％，并至少含有1个以上的肽段的蛋白质为成功鉴定蛋白质。7.根据权利要求1所述的梅花鹿鹿茸与鹿角的鉴别方法，其特征在于，所述步骤一中漩涡震荡时间为1分钟；冰上裂解时间为2小时；离心转速为20000rpm，离心时间为15min。2CN107121485A说明书1/4页一种梅花鹿鹿茸与鹿角的鉴别方法技术领域[0001]本发明属于梅花鹿鹿茸产品的质量鉴定领域，主要涉及一种利用肽聚糖识别蛋白1鉴别梅花鹿鹿茸与鹿角的方法。背景技术[0002]鹿茸，鹿科动物梅花鹿或马鹿未骨化的角，为我国传统名贵中药。《本草纲目》记载