一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107227283A(43)申请公布日2017.10.03(21)申请号201710385500.5C12P13/04(2006.01)(22)申请日2017.05.26C12R1/15(2006.01)(83)生物保藏信息CGMCCNo.137572017.03.15CGMCCNo.137562017.03.15(71)申请人廊坊梅花生物技术开发有限公司地址065001河北省廊坊市开发区华祥路66号(72)发明人杨晟蒋宇钱峰慧杨俊杰程江红吴涛胡丹刁刘洋(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司11227代理人赵青朵(51)Int.Cl.权利要求书1页说明书5页C12N1/21(2006.01)序列表1页(54)发明名称一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用(57)摘要本发明属于微生物领域，具体涉及一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用。本发明所述谷氨酸棒杆菌其细胞内编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因的第361位丝氨酸突变为苯丙氨酸。本发明所述谷氨酸棒杆菌对戊糖磷酸途径中的gnd基因进行点突变，使得6-磷酸葡糖酸脱氢酶的第361位的丝氨酸被苯丙氨酸替代，而减弱6-磷酸葡糖酸脱氢酶的变构调节，从而增强NADPH再生能力，为脯氨酸合成提供充足的NADPH，进而提高脯氨酸的产量。实验表明本发明所述谷氨酸棒杆菌为L-脯氨酸高产菌株，能有效积累L-脯氨酸，提高L-脯氨酸的产量，为L-脯氨酸的工业化生产奠定了基础。CN107227283ACN107227283A权利要求书1/1页1.一种具有产生L-脯氨酸的能力的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，gnd基因的第361位丝氨酸突变为苯丙氨酸。2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌，所述谷氨酸棒杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.13757。3.权利要求1所述谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，包括：步骤A、构建编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因的第361位丝氨酸突变为苯丙氨酸的重组质粒；步骤B、将重组质粒转化谷酸棒杆菌MHZ-0700，用含卡那霉素的选择培养基筛选转化子，将筛得的转化子用液体脑心浸液培养基培养；步骤C、培养物稀释后涂布在含有10％蔗糖的固体脑心浸液培养基上，培养获得重组菌株。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤A所述重组质粒为pK18mobsacB-gnd361。5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤B所述含卡那霉素的选择培养基中卡那霉素的浓度为15mg/L；步骤B所述培养为33℃、220rpm振荡培养过夜；步骤C所述培养为33℃静置培养48h。6.权利要求1或2所述谷氨酸棒杆菌在发酵生产L-脯氨酸中的应用。7.一种L-脯氨酸的生产方法，其特征在于，将细胞内编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因的第361位丝氨酸突变为苯丙氨酸的谷氨酸棒杆菌接种于种子培养基进行扩繁，然后将扩繁后的培养物转入发酵培养基发酵。8.根据权利要求7所述生产方法，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌保藏编号为CGMCCNo.13757。9.根据权利要求7所述生产方法，其特征在于，所述种子培养基中玉米浆2.5％，葡萄糖1.0％，硫酸铵0.4％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.1％，尿素0.1％，CaCO30.5％，余量为水，pH7.2；所述发酵培养基中玉米浆0.6％，葡萄糖12.0％，硫酸铵3.7％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.1％，CaCO34％，VH70μg/L，VB1·HCl80μg/L，余量为水，pH7.2。10.根据权利要求7所述生产方法，其特征在于，所述发酵条件为33℃，发酵72h。2CN107227283A说明书1/5页一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用技术领域[0001]本发明属于微生物领域，具体涉及一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用，尤其是涉及一种产L-脯氨酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用背景技术[0002]L-脯氨酸(L-proline)，化学名称为L-吡咯烷酮羧酸，分子式为C5H9NO2，相对分子质量为115。脯氨酸是构成蛋白质的基本单位，是组成人体蛋白质的21种氨基酸之一。脯氨酸广泛应用于医药、食品及调味剂、农业和有机化学。作为氨基酸类药物，脯氨酸是复方氨基酸大输液原料之一，用于营养不良、蛋白质缺乏症、严重胃肠道疾病，烫伤及外科手术后的蛋白质补充。脯氨酸可以调节细胞的渗透压，稳定蛋白的结构。随着研究不断深入，脯氨酸的应用范围也进一步扩大。因此，脯氨酸的生产具有非常广泛的应用前景。[0003]目前，L-脯氨酸的生产方法有三种：化学合成法、酶解法、微生物发酵法。化学合成法和酶解法由于原料来源受限制、生产成本高、污染环境，难以实现大规模工业化生产。微生物