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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110951661A(43)申请公布日2020.04.03(21)申请号201911368695.8(22)申请日2019.12.26(71)申请人新疆梅花氨基酸有限责任公司地址831300新疆维吾尔自治区昌吉回族自治州五家渠工业园区北二西街1289号(72)发明人王成胡丹吴涛(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司11227代理人刘伟(51)Int.Cl.C12N1/21(2006.01)C12N15/77(2006.01)C12P13/14(2006.01)C12R1/15(2006.01)权利要求书2页说明书9页序列表5页附图1页(54)发明名称一种高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用(57)摘要本发明属于生物工程技术领域,公开了一种高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用。本发明所述高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌其细胞内α-酮戊二酸脱氢酶和/或谷氨酸外运蛋白活性丧失,并且谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化修饰解除。本发明所述高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌能使L-谷氨酰胺在培养基或细胞中积累,很大程度提高L-谷氨酰胺的产量。实验表明本发明所述谷氨酸棒杆菌为L-谷氨酰胺高产菌株,产生L-谷氨酰胺的能力与未修饰菌株相比得到增强,能有效积累L-谷氨酰胺,提高L-谷氨酰胺的产量,且具有较高的转化率,为L-谷氨酰胺的工业化生产奠定了基础,具有广泛的工业应用前景。CN110951661ACN110951661A权利要求书1/2页1.一种高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌,其特征在于,其细胞内α-酮戊二酸脱氢酶和/或谷氨酸外运蛋白活性丧失,并且谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化修饰解除。2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌,其特征在于,所述α-酮戊二酸脱氢酶活性丧失为编码突变α-KGDH蛋白质的Elo亚基的odhA基因片段缺失;所述谷氨酸外运蛋白活性丧失为编码突变YggB蛋白的yggB基因片段缺失;所述谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化修饰解除为编码GS蛋白质的glnA基因ORF区405位酪氨酸突变为苯丙氨酸。3.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌,其特征在于,所述odhA基因片段缺失为odhA基因ORF序列1位-500位500bp核苷酸序列被敲除;所述yggB基因片段缺失为yggB基因ORF序列1位-500位500bp核苷酸序列被敲除。4.权利要求1-3任一项所述的谷氨酸棒杆菌的构建方法,其特征在于,制备odhA基因片段缺失重组载体、yggB基因片段缺失重组载体和glnAY405F点突变重组载体,将odhA基因片段缺失重组载体和/或yggB基因片段缺失重组载体以及glnAY405F点突变重组载体转化谷氨酸棒杆菌获得高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌。5.根据权利要求4所述的构建方法,所述谷氨酸棒杆菌为ATCC13032菌株;所述载体为pK18mobsacB。6.根据权利要求4所述的构建方法,其特征在于,所述制备odhA基因片段缺失重组载体的方法具体为以A1/A2、A3/A4作为引物,以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA作为模板扩增odhA碱基缺失位点的上、下游片段,利用引物组A1/A4进行overlapPCR扩增得到odhA基因片段缺失产物,与pK18mobsacB载体连接得到pK18mobsacB-ΔodhA重组质粒;所述制备yggB基因片段缺失重组载体的方法具体为以B1/B2、B3/B4作为引物,以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA作为模板扩增yggB碱基缺失位点的上、下游片段,利用引物组B1/B4进行overlapPCR扩增得到yggB基因片段缺失产物,与pK18mobsacB载体连接得到pK18mobsacB-ΔyggB重组质粒;所述制备glnAY405F点突变重组载体的方法具体为以C1/C2、C3/C4作为引物,以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA作为模板扩增glnA基因点突变的上、下游片段,利用引物组C1/C4进行overlapPCR扩增得到glnA基因点突变产物,与pK18mobsacB载体连接得到pK18mobsacB-glnAY405F重组质粒。7.根据权利要求6所述的构建方法,其特征在于,所述A1的序列如SEQIDNo.1所示;所述A2的序列如SEQIDNo.2所示;所述A3的序列如SEQIDNo.3所示;所述A4的序列如SEQIDNo.4所示;所述B1的序列如SEQIDNo.5所示;所述B2的序列如SEQIDNo.6所示;所述B3的序列如SEQIDNo.7所示;所述B4的序列如SEQIDNo.8所示;所述C1的序列如SEQIDNo.9所示;所述C2的序列如SEQIDNo.10所示;所述C3的序列如SEQIDNo.11