鹿源牛病毒性腹泻灭活疫苗及其制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108300703A(43)申请公布日2018.07.20(21)申请号201810123919.8C12N7/04(2006.01)(22)申请日2018.02.07A61K39/12(2006.01)A61P31/14(2006.01)(83)生物保藏信息CGMCCNo.152832018.01.11(71)申请人吉林农业大学地址130118吉林省长春市净月开发区新城大街2888号(72)发明人冷雪杜锐时坤李健明宫庆龙孙志博郜艳雪徐宁栾美惠(74)专利代理机构长春众邦菁华知识产权代理有限公司22214代理人于晓庆(51)Int.Cl.权利要求书1页说明书5页C12N7/00(2006.01)序列表2页附图2页(54)发明名称鹿源牛病毒性腹泻灭活疫苗及其制备方法(57)摘要鹿源牛病毒性腹泻灭活疫苗及其制备方法，涉及疫苗技术领域，填补了梅花鹿病毒性腹泻/黏膜病专用疫苗的空白。本发明的鹿源牛病毒性腹泻病毒JL05株，该菌株已于2018年1月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.15283。本发明使用MDBK细胞对鹿源BVDVJL05株病毒进行传代并进行噬斑克隆纯化病毒，经检测鹿源BVDVJL05株7.2病毒含量达10TCID50/ml以上，且无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染，符合制苗用病毒要求。将病毒经BEI灭活后与206佐剂混合乳化制备疫苗，经安全性和效力检验证明，该疫苗对梅花鹿安全，攻毒保护率可达100％。CN108300703ACN108300703A权利要求书1/1页1.鹿源牛病毒性腹泻病毒JL05株，其特征在于，该菌株已于2018年1月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.15283。2.利用权利要求1所述的鹿源牛病毒性腹泻病毒JL05株制备的鹿源牛病毒性腹泻病毒JL05株灭活疫苗。3.制备权利要求2所述的鹿源牛病毒性腹泻病毒JL05株灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、制备鹿源牛病毒性腹泻病毒JL05株抗原液；步骤二、将鹿源牛病毒性腹泻病毒JL05株抗原液加入BEI进行灭活，BEI终浓度为3～4mM，灭活时间为18～24h；步骤三、将灭活后的鹿源牛病毒性腹泻病毒JL05株抗原液加入10％(W/V)硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％(W/V)；再将其与206佐剂按体积比1:1～1.2:1进行混合乳化反应10～20min，疫苗乳化转数为120～200r/min，获得鹿源牛病毒性腹泻病毒JL05株灭活疫苗。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤一之前还包括以下步骤：鹿源牛病毒性腹泻病毒JL05株的传代与噬斑克隆纯化：将分离的鹿源牛病毒性腹泻病毒JL05株经MDBK细胞进行体外连续传代，至30代，其间每隔5代进行噬斑克隆纯化病毒，即F5、F10、F15、F20、F25代进行噬斑克隆纯化病毒。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，鹿源牛病毒性腹泻病毒JL05株的传代与噬斑克隆纯化的具体过程如下：取鹿源牛病毒性腹泻病毒JL05株病毒进行10倍系列稀释，稀释度范围为10-2～10-6，病毒稀释后接种长满80％单层的MDBK细胞的6孔细胞培养板，1ml/孔，吸附1h后弃病毒液，用无血清的DMEM清洗3次，加入2×DMEM与灭菌琼脂液的混合液，3ml/孔，室温冷却后置于37℃、5％CO2培养箱中培养3～4d，观察噬斑，挑取单个噬斑保存并进行传代。6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤一中，利用转瓶贴壁培养细胞制备鹿源牛病毒性腹泻病毒JL05株抗原液：在转瓶中培养MDBK细胞，细胞长满90～100％单层时，以胰酶-EDTA细胞分散液消化传代，以1:3～1:5的比例分散至新的转瓶中，细胞生长液为含5～8％新生牛血清的DMEM；当细胞生长至80～90％单层时，以感染剂量MOI为0.01～0.05将鹿源牛病毒性腹泻病毒JL05株接种到MDBK细胞中，细胞维持液为含3％马血清的DMEM，继续培养60～84h，当细胞病变达到80～90％时收获病毒液，-20℃保存备用。7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤一中，利用微载体悬浮培养技术制备鹿源牛病毒性腹泻病毒JL05株抗原液：在转瓶中培养MDBK细胞，细胞长满90～100％单层时，以胰酶-EDTA细胞分散液消化，接种入细胞培养反应器，细胞接种密度为1×106～3×106个/ml，微载体的加入量为3～5g/L，细胞生长液为含5～8％新生牛血清的DMEM，搅拌速度为40～100r/min，温度为36℃，PH为7.2～7.4；当微载体上70～80％汇满细胞后，弃生长液，加入含2～3％马