一种人参皂苷Ro的制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109022530A(43)申请公布日2018.12.18(21)申请号201810643870.9(22)申请日2018.06.21(71)申请人天津市尖峰天然产物研究开发有限公司地址300457天津市经济技术开发区黄海三街5号(72)发明人孙华庚刘莹(74)专利代理机构北京泛华伟业知识产权代理有限公司11280代理人李渤郭广迅(51)Int.Cl.C12P33/20(2006.01)C12R1/80(2006.01)权利要求书2页说明书7页(54)发明名称一种人参皂苷Ro的制备方法(57)摘要本发明提供了一种保藏编号为CGMCCNo.3.3262的梅林青霉菌株在制备人参皂苷Ro中的用途。本发明还提供了使用本发明的梅林青霉菌株制备人参皂苷Ro的方法。本发明首次实现利用梅林青霉菌株生物转化生产人参皂苷Ro，人参皂苷Ro的摩尔转化率达56％以上；本发明只需使用本发明的菌株进行转化，生产成本低，工艺简单，经济效益可观。CN109022530ACN109022530A权利要求书1/2页1.一种人参皂苷Ro的制备方法，所述方法包括使用保藏编号为CGMCCNo.3.3262的梅林青霉菌株转化底物齐墩果酸。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括使用保藏编号为CGMCCNo.3.3262的梅林青霉菌株在全自动发酵罐中经发酵转化底物齐墩果酸。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤：1)将保藏编号为CGMCCNo.3.3262的梅林青霉菌株从固体土豆培养基接种至预先配制好的液体土豆培养基中，置于全自动发酵罐中进行培养获得发酵液；2)将齐墩果酸溶于甲醇、乙醇或其水溶液中，制备为10～100g/L的溶液，加入到步骤1)得到的发酵液中继续发酵培养；优选地，将齐墩果酸溶于甲醇、乙醇或其水溶液中，制备为20～80g/L的溶液；更优选地，将齐墩果酸溶于甲醇、乙醇或其水溶液中，制备为40～50g/L的溶液；3)收集步骤2)得到的发酵液，离心甩滤后收集滤液，减压浓缩至原体积的1/10～1/20，用大孔树脂柱层析分离，以体积比为70:30～0:100的不同浓度的水-乙醇或水-甲醇洗脱，富集转化产物，即为人参皂苷Ro。4.根据权利要求3所述的方法，其中，在步骤1)中，所述固体土豆培养基包含10～50g/L的葡萄糖和10～20g/L的葡萄糖醛酸；优选地，所述固体土豆培养基包含20～40g/L的葡萄糖和12～18g/L的葡萄糖醛酸；更优选地，所述固体土豆培养基包含30g/L的葡萄糖和15g/L的葡萄糖醛酸。5.根据权利要求3所述的方法，其中，在步骤1)中，所述液体土豆培养基包含10～50(g/L)的葡萄糖和10～20(g/L)的葡萄糖醛酸；优选地，所述液体土豆培养基包含20～40(g/L)的葡萄糖和12～18(g/L)的葡萄糖醛酸；更优选地，所述液体土豆培养基包含30(g/L)的葡萄糖和15(g/L)的葡萄糖醛酸。6.根据权利要求3所述的方法，其中在步骤1)中，所述培养条件如下：培养温度为24～32℃，pH值为4～6，通气比为0.1～10％(v/v)，搅拌速率为100～360rpm/min，发酵培养24～72小时；优选地，所述培养条件如下：培养温度26～30℃，pH值为4.5～5.5，通气比为1～8％(v/v)，搅拌速率为180～260rpm/min，发酵培养36～60小时；更优选地，所述培养条件如下：培养温度28度，pH值为5，通气比为5％(v/v)，搅拌速率为200rpm/min，发酵培养48小时。7.根据权利要求3所述的方法，其中，在步骤2)中，所述发酵培养的条件如下：培养温度为24～32℃，搅拌速率为100～360rpm/min，发酵培养时间48～120小时；优选地，所述发酵培养的条件如下：培养温度26～30℃，搅拌速率为200～300rpm/min，发酵培养时间60～96小时；更优选地，所述发酵培养的条件如下：培养温度28℃，搅拌速率为220rpm/min，发酵培养时间72～84小时。8.根据权利要求3所述的方法，其中在步骤2)中，所述甲醇水溶液为体积百分比浓度不2CN109022530A权利要求书2/2页低于70％的甲醇水溶液；所述乙醇水溶液为体积百分比浓度不低于70％的乙醇水溶液；优选地，所述发酵培养中，齐墩果酸底物用量与发酵液的比例用量范围为10g～100g/100L；更优选地为20g～80g/100L；更进一步优选地为40g～50g/100L。9.根据权利要求3所述的方法，其中在步骤3)中，所述大孔树脂选自HP20型大孔树脂、D101型大孔树脂、AB-8型大孔树脂或YWD-01型大孔树脂中的一种或多种；优选地，在步骤3)中，所述转化产物的纯化使用