梅毒螺旋体心磷脂抗体定量检测试剂盒及其制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109212209A(43)申请公布日2019.01.15(21)申请号201811076255.0(22)申请日2018.09.14(71)申请人厦门大学附属中山医院地址361004福建省厦门市思明区湖滨南路201-209号申请人厦门市波生生物技术有限公司(72)发明人刘莉莉杨天赐童曼莉林勇朱晓桢林丽蓉张长弓(74)专利代理机构厦门南强之路专利事务所(普通合伙)35200代理人马应森(51)Int.Cl.G01N33/571(2006.01)G01N33/535(2006.01)G01N33/92(2006.01)权利要求书2页说明书5页附图1页(54)发明名称梅毒螺旋体心磷脂抗体定量检测试剂盒及其制备方法(57)摘要梅毒螺旋体心磷脂抗体定量检测试剂盒及其制备方法，涉及梅毒螺旋体。梅毒螺旋体心磷脂抗体定量检测试剂盒设有心磷脂抗原包被微孔板、辣根过氧化物酶标记的抗人Ig单克隆抗体、显色液A、显色液B、浓缩洗涤液、反应终止液、校准品和外包装盒。1)提取梅毒螺旋体外膜；2)提取梅毒螺旋体心磷脂抗原；3)制备心磷脂抗原包被微孔板；4)制备抗人Ig单克隆抗体；5)标记抗人Ig单克隆抗体的辣根过氧化物酶；6)提供校准品；7)提供显色液A；8)提供显色液B；9)制备浓缩洗涤液；10)制备反应终止液；11)制备梅毒螺旋体心磷脂抗体定量检测试剂盒。采用梅毒螺旋体来源的心磷脂抗原，实现梅毒螺旋体心磷脂抗体定量检测。CN109212209ACN109212209A权利要求书1/2页1.梅毒螺旋体心磷脂抗体定量检测试剂盒，其特征在于设有心磷脂抗原包被微孔板、辣根过氧化物酶标记的抗人Ig单克隆抗体、显色液A、显色液B、浓缩洗涤液、反应终止液、校准品和外包装盒；所述辣根过氧化物酶标记的抗人Ig单克隆抗体、显色液A、显色液B、浓缩洗涤液、反应终止液和校准品均装在相应的聚乙烯瓶中并与心磷脂抗原包被微孔板一起装在外包装盒内。2.如权利要求1所述梅毒螺旋体心磷脂抗体定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)提取梅毒螺旋体外膜；2)提取梅毒螺旋体心磷脂抗原；3)制备心磷脂抗原包被微孔板；4)制备抗人Ig单克隆抗体；5)标记抗人Ig单克隆抗体的辣根过氧化物酶；6)提供校准品；7)提供显色液A；8)提供显色液B；9)制备浓缩洗涤液；10)制备反应终止液；11)制备梅毒螺旋体心磷脂抗体定量检测试剂盒。3.如权利要求2所述梅毒螺旋体心磷脂抗体定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述提取梅毒螺旋体外膜的具体方法为：用超声裂解器充分裂解梅毒螺旋体，8000r/min4℃离心20min除去大的细菌碎片，100000g4℃离心2h获得梅毒螺旋体外膜。4.如权利要求2所述梅毒螺旋体心磷脂抗体定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述提取梅毒螺旋体心磷脂抗原的具体方法为：取梅毒螺旋体外膜4mg，加入1mL氯仿和0.5mL甲醇，充分振荡，并于37℃水浴20min，再加入1.5mL甲醇，振荡，500g离心5min，留取上清，向上清液中加入3mL氯仿，然后加入1.2mL溶液Ⅰ，500g离心5min，溶液Ⅰ分为2层，用吸管吸走上层溶液，然后沿管壁加入1.2mL溶液Ⅱ，旋转，待分层后再将上层相吸走，重复2次，在微弱氮气流下将溶剂挥发，获得梅毒螺旋体心磷脂抗原；所述溶液Ⅰ的组成可为1.80mmol/LCaCl2、1.79mmol/LMgCl2和49.57mmol/LNaCl的水溶液；所述溶液Ⅱ的组成可为氯仿、甲醇和水，所述氯仿、甲醇和水的体积比可为3︰48︰47。5.如权利要求2所述梅毒螺旋体心磷脂抗体定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述制备心磷脂抗原包被微孔板的具体方法为：将步骤3)得到的梅毒螺旋体心磷脂抗原以质量体积浓度0.003％，每孔25μL加入微孔板中，4℃包被24h；取出心磷脂抗原包被微孔板，风干；100μL用pH7.4磷酸盐缓冲液配制的胎牛血清溶液，室温封闭1h，取出后用磷酸盐缓冲液洗涤5次，室温风干，得心磷脂抗原包被微孔板，密封备用。6.如权利要求2所述梅毒螺旋体心磷脂抗体定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述制备抗人Ig单克隆抗体的具体方法为：以人Ig为抗原免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术，筛选获得稳定分泌抗人Ig单克隆抗体的杂交瘤细胞株，采用酶联免疫吸附法鉴定McAb效价在1∶107以上。7.如权利要求2所述梅毒螺旋体心磷脂抗体定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于2CN109212209A权利要求书2/2页在步骤5)中，所述标记抗人Ig单克隆抗体的辣根过氧化物酶采用过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶标记。8.如权利要求2所述梅毒