一种虎源伪狂犬病毒的检测试剂盒及检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111560466A(43)申请公布日2020.08.21(21)申请号201911414529.7(22)申请日2019.12.31(71)申请人龙岩学院地址364012福建省龙岩市新罗区东肖北路1号申请人福建梅花山华南虎繁育研究所青岛英赛特生物科技有限公司(72)发明人范克伟林开雄包银莉郑琳傅文源黄翠琴杨守深(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/6851(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书4页序列表1页附图2页(54)发明名称一种虎源伪狂犬病毒的检测试剂盒及检测方法(57)摘要本发明属于动物疫病分子生物学检验方法及检验试剂领域，特别涉及一种虎源伪狂犬病毒的检测试剂盒及检测方法，通过对5株虎源伪狂犬病毒进行高通量测序后组装获得虎源伪狂犬的全基因组序列，并与多株猪伪狂犬病毒进行比对发现虎源伪狂犬病毒基因组中存在多处单核酸突变，发明针对其中一个单核苷酸突变进行检测虎源伪狂犬病毒，设计一对伪狂犬病毒的检测引物和一条检测虎源伪狂犬病毒的Cycling探针组成检查试剂盒，虎源伪狂犬病毒的检测，该检测方法具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点，反应结束即时便可根据扩增曲线判定结果。CN111560466ACN111560466A权利要求书1/1页1.一种虎源伪狂犬病毒的检测试剂盒，其特征在于基于CycleavePCR技术，包括以下引物对和探针：检测虎源伪狂犬病毒的引物对和Cycling探针，所述检测虎源伪狂犬病毒的引物对为SEQIDNO：1所示的上游引物Tiger-RPV-F和SEQIDNO：2所示的下游引物Tiger-RPV-R，所述Cycling探针为探针Tiger-RPV-Pro且其序列为SEQIDNO：3所示。2.根据权利要求1所述的一种虎源伪狂犬病毒的检测试剂盒，其特征在于：所述上游引物Tiger-RPV-F、下游引物Tiger-RPV-R、探针Tiger-RPV-Pro的终浓度均为2mM到10mM。3.根据权利要求1或2所述的一种虎源伪狂犬病毒的检测试剂盒，其特征在于：所述探针Tiger-RPV-Pro的5'标记的荧光基团为FAM、VIC、HEX、CY5中的一种；所述探针Tiger-RPV-Pro的3'标记的淬灭基团为BQ1、BQ2中的一种。4.根据权利要求1所述的一种虎源伪狂犬病毒的检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒中还包括有酶液和反应缓冲液，所述酶液由DNA聚合酶和RNA酶H组成。5.根据权利要求1所述的一种虎源伪狂犬病毒的检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒中还包括有阴性对照和阳性对照；所述阴性对照为用0.01mol/L、pH7.2的PBS缓冲盐水；所述阳性对照为将虎源伪狂犬病毒PCR扩增产物与克隆载体pMD-18-Tvector连接，转化大肠杆菌感受态DH5α，获得阳性克隆菌株，并制备质粒pMD18-tiger-RPV作为阳性对照。6.一种权利要求要求1所述的虎源伪狂犬病毒的检测试剂盒的检测方法，其特征在于按照以下步骤进行：(1)提取待测病毒核酸模板，选用商品化的病毒核酸提取试剂盒；(2)配置扩增反应体系，体系为：17μLCycleavePCR扩增反应液，3μL待测病毒核酸模板，反应体系的总体积为20μL；(3)荧光定量PCR扩增：将步骤(2)配制好的扩增反应体系置于荧光定量PCR仪中进行扩增，并进行信号采集；(4)结果判定：在相应通道查看扩增曲线在36个循环以内曲线良好的反应直接判定为阳性，36个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。7.根据权利要求6所述的一种虎源伪狂犬病毒的检测试剂盒的检测方法，其特征在于：所述CycleavePCR扩增反应液包含10μL的2XCycleavePCRReactionMixture，各0.5μL权利要求1中所述的引物和探针，剩余为无菌水。8.根据权利要求6所述的一种虎源伪狂犬病毒的检测试剂盒的检测方法，其特征在于所述扩增反应条件：预变性95℃预变性30s；95℃变性10s，50℃退火30s，72℃延伸30s并采集荧光信号40个循环。2CN111560466A说明书1/4页一种虎源伪狂犬病毒的检测试剂盒及检测方法技术领域[0001]本发明属于动物疫病分子生物学检验方法及检验试剂领域，特别涉及一种虎源伪狂犬病毒的检测试剂盒及检测方法。背景技术[0002]虎源伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)感染引起的家畜及野生动物的急性传染病，是引起世界养猪业重大经济损失的病原之一。猪是该病的储存宿主和主要传染源，临床症状以发热、神经系统和呼吸障碍为主要特征。哺乳期仔猪和幼猪对该病毒最为敏感，感染后