伪狂犬病毒IE180基因启动子活性报告质粒、检测试剂盒及其检测方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115838761A(43)申请公布日2023.03.24(21)申请号202210898603.2(22)申请日2022.07.28(71)申请人扬州大学地址225000江苏省扬州市大学南路88号(72)发明人李向东连拯民刘盼娆朱振邦(74)专利代理机构北京风雅颂专利代理有限公司11403专利代理师李翔(51)Int.Cl.C12N15/85(2006.01)C12N15/113(2010.01)C12N15/65(2006.01)C12N15/66(2006.01)C12Q1/66(2006.01)权利要求书1页说明书4页序列表（电子公布）附图2页(54)发明名称伪狂犬病毒IE180基因启动子活性报告质粒、检测试剂盒及其检测方法和应用(57)摘要本发明涉及病毒学技术领域，具体涉及一伪狂犬病毒IE180基因启动子活性报告质粒、检测试剂盒及其检测方法和应用，所述基因启动子活性报告质粒是通过PCR扩增得到伪狂犬病毒IE180基因启动子序列，并克隆至pGL3‑Basic载体构建而成，所述伪狂犬病毒IE180基因启动子活性报告质粒序列如SEQIDNO.1所示。本发明利用萤火虫荧光素酶报告基因构建伪狂犬病毒IE180基因启动子活性报告质粒，通过双荧光素酶检测系统，检测IE180基因启动子活性；该检测方法可以用于筛选IE180基因转录因子。CN115838761ACN115838761A权利要求书1/1页1.一种伪狂犬病毒IE180基因启动子活性报告质粒，其特征在于，所述基因启动子活性报告质粒是通过PCR扩增得到猪伪狂犬病毒IE180基因启动子序列，并克隆至pGL3‑Basic载体构建而成，所述猪伪狂犬病毒IE180基因启动子活性报告质粒序列如SEQIDNO.1所示。2.一种伪狂犬病毒IE180基因启动子活性检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述基因启动子活性报告质粒，所述猪伪狂犬病毒IE180基因启动子序列是自猪伪狂犬病毒IE180基因CDS区域5’端的前一个碱基开始，向5’方向延伸3600bp，序列如SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求2所述伪狂犬病毒IE180基因启动子活性检测试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增反应的体系中所用模板为伪狂犬病毒全基因组DNA，采用的引物序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。4.根据权利要求3所述伪狂犬病毒IE180基因启动子活性检测试剂盒,其特征在于，所述PCR反应的条件为98℃2min，98℃10s，55℃15s，72℃30s，35个循环，72℃10min。5.根据权利要求2所述伪狂犬病毒IE180基因启动子活性检测试剂盒，其特征在于，将PCR扩增得到的IE180基因启动子DNA片段克隆至pGL3‑Basic载体的方法包括如下步骤：1)使用限制性核酸内切酶XhoI和HindIII将pGL3‑Basic载体酶切线性化，并纯化得到线性化的pGL3‑Basic载体；2)利用同源重组的方法将PCR扩增获得的IE180基因启动子DNA片段与线性化的pGL3‑Basic载体连接获得猪伪狂犬病毒IE180基因启动子活性报告质粒pGL3‑pIE180。6.采用权利要求2‑5任一项伪狂犬病毒IE180基因启动子活性检测试剂盒的检测方法，其特征在于，将猪伪狂犬病毒IE180基因启动子活性报告质粒pGL3‑pIE180转染细胞后，利用萤火虫荧光素酶报告基因所表达的荧光素酶的活性反应IE180基因启动子活性。7.根据权利要求6所述检测方法，其特征在于，所述猪伪狂犬病毒IE180基因启动子活性报告质粒pGL3‑pIE180转染细胞的过程中，同时转染稳定表达海肾荧光素酶的质粒pRL‑CMV作为内参，转染比例为10:1。8.根据权利要求6所述检测方法，其特征在于，转染细胞后24h裂解细胞，收集上清，利用双荧光素酶活性检测试剂盒检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性，通过两种发光值的比值判断猪伪狂犬病毒IE180基因启动子活性。9.权利要求1所述伪狂犬病毒IE180基因启动子活性报告质粒在转录激活/抑制因子或猪伪狂犬病毒潜伏感染激活/抑制因子中的应用。10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，将待检测的激活/抑制因子真核表达载体与启动子活性报告质粒pGL3‑pIE180共转染细胞，转染24h后，检测启动子活性的差异。2CN115838761A说明书1/4页伪狂犬病毒IE180基因启动子活性报告质粒、检测试剂盒及其检测方法和应用技术领域[0001]本发明涉及病毒学技术领域，尤其涉及一伪狂犬病毒IE180基因启动子活性报告质粒、检测试剂盒及其检测方法和应用。背景技术[0002]猪伪狂犬病毒(PRV)是一种双链DNA病毒，属于疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科、