产L-苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112481179A(43)申请公布日2021.03.12(21)申请号202011388854.3(22)申请日2020.12.01(71)申请人廊坊梅花生物技术开发有限公司地址065001河北省廊坊市开发区华祥路66号(72)发明人刘慧敏尹春筱康培(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人黄爽(51)Int.Cl.C12N1/21(2006.01)C12N15/70(2006.01)C12N15/64(2006.01)C12P13/08(2006.01)C12R1/19(2006.01)权利要求书6页说明书20页(54)发明名称产L-苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用(57)摘要本发明公开了产L‑苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明通过强化L‑苏氨酸生产菌株的生物素合成，尤其是pyc基因得到强化的菌株，采用的具体手段为强化bioABFCD基因(包括启动子强化、RBS序列强化、多拷贝)，解除birA基因转录阻遏，以及强化bioABFCD的同时解除birA转录阻遏。构建得到的产L‑苏氨酸的基因工程菌，经发酵培养，L‑苏氨酸产量可达20.2g/L，糖酸转化率可达23.8％。CN112481179ACN112481179A权利要求书1/6页1.产L‑苏氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌选自A～C中的任一种：A、通过增强大肠杆菌中编码NCBI参考序列NC_000913.3的基因bioABFCD，获得的基因增强菌株；B、通过弱化大肠杆菌中编码NCBI参考序列NC_000913.3的基因birA，获得的基因弱化菌株；C、通过增强大肠杆菌中编码NCBI参考序列NC_000913.3的基因bioABFCD，同时弱化大肠杆菌中编码NCBI参考序列NC_000913.3的基因birA，获得的基因工程菌。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，增强的途径选自以下1)～3)中的至少一种：1)通过将强启动子与所述基因可操作地连接而增强；2)通过增加染色体上所述基因的拷贝数而增强；3)通过增加染色体上所述基因启动子的RBS序列的强度而增强；所述弱化包括敲除或降低所述基因的表达；弱化的方法选自诱变、定点突变、同源重组中的至少一种。3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述强启动子选自Ptac、Plac、Ptrp、Ptrc。4.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，定点突变的方法选自S1～S3中的任一种：S1、对基因birA进行定点突变，突变后基因birA编码蛋白的第57位氨基酸由G突变为S；S2、对基因birA进行定点突变，突变后基因birA编码蛋白的第58位氨基酸由Y突变为F；S3、对基因birA进行定点突变，突变后基因birA编码蛋白的第57位氨基酸由G突变为S，且第58位氨基酸由Y突变为F。5.根据权利要求1‑4任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌为保藏编号为CGMCCNo.13403的大肠杆菌MHZ‑0215‑2。6.产L‑苏氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法选自以下方案I～V，或任选的组合：方案I、利用基因工程手段将强启动子Ptac与大肠杆菌中的基因bioABFCD可操作地连接；方案II、利用基因工程手段增加大肠杆菌中基因bioABFCD的拷贝数；方案III、利用基因工程手段增加大肠杆菌中基因bioABFCD启动子的RBS序列的强度；方案IV、利用基因工程手段对大肠杆菌中的基因birA进行定点突变，突变后基因birA编码蛋白的第57位氨基酸由G突变为S；方案V、利用基因工程手段对大肠杆菌中的基因birA进行定点突变，突变后基因birA编码蛋白的第58位氨基酸由Y突变为F。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法选自i～vi中的任一种：i、利用基因工程手段将强启动子Ptac与大肠杆菌中的基因bioABFCD可操作地连接，同时对大肠杆菌中的基因birA进行定点突变，突变后基因birA编码蛋白的第57位氨基酸由G突变为S；ii、利用基因工程手段将强启动子Ptac与大肠杆菌中的基因bioABFCD可操作地连接，2CN112481179A权利要求书2/6页同时对大肠杆菌中的基因birA进行定点突变，突变后基因birA编码蛋白的第58位氨基酸由Y突变为F；iii、利用基因工程手段增加大肠杆菌中基因bioABFCD的拷贝数，同时对大肠杆菌中的基因birA进行定点突变，突变后基因birA编码蛋白的第57位氨基酸由G突变为S；iv、利用基因工程手段增加大肠杆菌中基因bioABFCD的拷贝数，同时对大肠杆菌中的基因birA进行定点突变，突变后基因birA编码蛋白的第58位氨基酸由Y突变为