一种产R-(+)-紫苏醇的基因工程菌及其构建方法与应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110669712A(43)申请公布日2020.01.10(21)申请号201910993852.8C12N15/60(2006.01)(22)申请日2019.10.18C12N15/61(2006.01)C12P7/22(2006.01)(71)申请人中国科学院青岛生物能源与过程研C12R1/19(2006.01)究所地址266101山东省青岛市崂山区松岭路189号(72)发明人孙超张汝兵咸漠董先娟(74)专利代理机构哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司23211代理人邓宇(51)Int.Cl.C12N1/21(2006.01)C12N15/70(2006.01)C12N15/54(2006.01)C12N15/53(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表2页附图1页(54)发明名称一种产R-(+)-紫苏醇的基因工程菌及其构建方法与应用(57)摘要一种产R-(+)-紫苏醇的基因工程菌及其构建方法与应用，涉及基因工程及发酵工程领域，本发明提供工程菌是过表达HMG-CoA合成酶基因mvaS、乙酰CoA乙酰基转移酶mvaE、牦牛儿基焦磷酸合成酶基因GPPS、D-柠檬烯合成酶基因ClLS、对异丙基甲苯单氧合酶羟化酶基因cymAa、对异丙基甲苯单氧酶还原酶基因cymAb、MVA激酶ERG12基因、MVAP激酶ERG8基因、甲羟戊酸脱羧酶ERG19基因和异戊焦磷酸异构酶IDI基因。同时，本发明提供了产R-(+)-紫苏醇的应用方法，在5L罐发酵，能够异源合成R-(+)-紫苏醇45.3mg/L，本发明可用于R-(+)-紫苏醇的工业化合成。CN110669712ACN110669712A权利要求书1/1页1.一种产R-(+)-紫苏醇的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达HMG-CoA合成酶基因mvaS、乙酰CoA乙酰基转移酶mvaE、牦牛儿基焦磷酸合成酶基因GPPS、D-柠檬烯合成酶基因ClLS、对异丙基甲苯单氧合酶羟化酶基因cymAa、对异丙基甲苯单氧酶还原酶基因cymAb、MVA激酶ERG12基因、MVAP激酶ERG8基因、甲羟戊酸脱羧酶ERG19基因和异戊焦磷酸异构酶IDI基因，宿主菌为大肠杆菌。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述HMG-CoA合成酶基因mvaS，GeneBankID为AAG02439，来源于粪肠球菌E.facecalis；乙酰CoA乙酰基转移酶基因mvaE，GenBankNO.AAG02438，来源于粪肠球菌E.facecalis；焦磷酸合成酶GPPS基因，GenbankNo.AF513112.1，来源于巨冷衫Abiesgrandis；D-柠檬烯合成酶ClLS基因，GenbankNo.AF514287.1，来源于柠檬Citruslimon；对异丙基甲苯单氧合酶羟化酶cymAa基因，GenbankNo.AAB62299.1，来源恶臭假单胞菌PseudomonasputidaF1；对异丙基甲苯单氧酶还原酶cymAb基因，GenbankNo.AAB62300.1来源恶臭假单胞菌PseudomonasputidaF1；MVA激酶ERG12基因，GeneBankID：855248，来源Saccharomycescerevisiae；MVAP激酶ERG8基因，GeneBankID：855260，来源Saccharomycescerevisiae、甲羟戊酸脱羧酶ERG19基因，GeneBankID：855779，来源Saccharomycescerevisiae、异戊焦磷酸异构酶IDI基因GeneBankID：855986，来源Saccharomycescerevisiae。3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coliBL21(DE3)。4.权利要求1-3任意一项所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)构建重组质粒：分别构建包含mvaS、mvaE、GPPS、ClLS、cymAa和cymAb的重组质粒I和包含ERG12、ERG8、ERG19、IDI基因的重组质粒II；2)将步骤1)构建的重组质粒I和重组质粒II转化入宿主菌，得到产R-(+)-紫苏醇的工程菌。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤1)所述重组质粒I构建时用的中间载体为pET28a(+)；构建重组质粒II构建时所用的中间载体为pTrcHis2B。6.权利要求1-3任意一项所述的基因工程菌在发酵生产R-(+)-紫苏醇中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵生产R-(+)-紫苏醇的方法包括：将权利要求1-3任意一项所述的基因工程菌接种至发酵培养基中，发酵培养至OD600为18-20，然后加