一种高产L-苏氨酸的基因工程菌及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115960801A(43)申请公布日2023.04.14(21)申请号202211192796.6C12R1/63(2006.01)(22)申请日2022.09.28(71)申请人浙江大学杭州国际科创中心地址311200浙江省杭州市萧山区建设三路733号(72)发明人徐佳琪蒋宇孙兵兵杨晟杨立荣吴坚平(74)专利代理机构杭州初尘专利代理事务所(特殊普通合伙)33514专利代理师万静(51)Int.Cl.C12N1/21(2006.01)C12N15/74(2006.01)C12N15/31(2006.01)C12P13/08(2006.01)权利要求书1页说明书4页序列表（电子公布）附图2页(54)发明名称一种高产L-苏氨酸的基因工程菌及其应用(57)摘要本发明公开了一种高产L‑苏氨酸的基因工程菌及其应用，该基因工程菌的宿主细胞为需钠弧菌ATCC14048，宿主细胞基因组中的TDH基因、THRL基因被敲除，THRA基因的第433位甘氨酸突变为精氨酸；TDH基因、THRL基因和THRA基因的的碱基序列依次如SEQIDNO.1、2和3所示；重组质粒包含有RHTC基因；RHTC基因的碱基序列如SEQIDNO.4所示。本发明通过天然转化的基因编辑方法实现了2个基因的敲除和1个基因的点突变，并通过质粒过表达1个外源基因，首次构建获得能通过发酵法生产L‑苏氨酸的需钠弧菌，该工程菌生长周期短，能高产L‑苏氨酸，具有潜在商业应用前景。CN115960801ACN115960801A权利要求书1/1页1.一种基因工程菌，包括宿主细胞以及在宿主细胞中表达且自我复制的重组质粒，其特征在于，所述宿主细胞为需钠弧菌(Vibrionatriegens)ATCC14048，宿主细胞基因组中的TDH基因、THRL基因被敲除，THRA基因的第433位甘氨酸突变为精氨酸；所述TDH基因的碱基序列如SEQIDNO.1所示；THRL基因的碱基序列如SEQIDNO.2所示；THRA基因的碱基序列如SEQIDNO.3所示；所述重组质粒包含有RHTC基因；所述RHTC基因的碱基序列如SEQIDNO.4所示。2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述重组质粒的原始表达载体为pSU2718。3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，原始表达载体中，所述RHTC基因的上游启动子为lac启动子，碱基序列如SEQIDNO.5所示。4.如权利要求1～3任一项所述的基因工程菌在高产L‑苏氨酸中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，包括：将如权利要求1～3任一项所述的基因工程菌接至发酵培养基中，进行发酵培养，得到富含L‑苏氨酸的发酵产物。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基为：硫酸铵20～25g/L、磷酸氢二钾1～3g/L、酵母提取物0.5～1.5g/L、氯化钠10～20g/L、七水合硫酸镁0.5～1g/L、葡萄糖25～35g/L、五水合硫酸锰0.01～0.03g/L、七水合硫酸亚铁0.01～0.03g/L、硫胺素1～3mg/L。7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，以质量分数计，所述基因工程菌的接种量为1～2％。8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵培养的温度为30℃；时间为12小时。2CN115960801A说明书1/4页一种高产L‑苏氨酸的基因工程菌及其应用技术领域[0001]本发明涉及微生物应用技术领域，尤其涉及一种高产L‑苏氨酸的基因工程菌及其应用。背景技术[0002]L‑苏氨酸，又名L‑羟基丁氨酸，是一种重要的营养强化剂，因此被广泛应用于食品、医药和饲料行业。L‑苏氨酸可以强化谷物、糕点、乳制品，和色氨酸一样有恢复人体疲劳，促进生长发育的效果。医药上，由于苏氨酸的结构中含有羟基，对人体皮肤具有持水作用，与寡糖链结合，对保护细胞膜起重要作用，在体内能促进磷脂合成和脂肪酸氧化。L‑苏氨酸也是动物本身不能合成，但又十分需要的氨基酸，能用来精确平衡饲料的氨基酸组成，满足动物生长维持需要，提高增重和瘦肉率，因此常添加到未成年仔猪和家禽的饲料中，是猪饲料的第二限制氨基酸和家禽饲料的第三限制氨基酸。[0003]发酵法生产L‑苏氨酸的方法，有使用大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、产谷氨酸小球菌、黄色短杆菌等菌株，以葡萄糖、氨等原料发酵生产后，再经过精制而成。需钠弧菌是一种革兰氏阴性、对人类非致病的海洋细菌。其倍增时间在7～10分钟之间，传代速度比大肠杆菌快一倍，是已知代时最短的自由生活细菌。需钠弧菌与大肠杆菌相比，有相似的功能元件和培养条件，或可称为大肠杆菌有潜力的替代宿主。需钠弧菌的高生长和高底物摄取速率在发酵应用时，有望在前期快速生长，缩短发酵延滞期，在工业生产中节约能量和时间成本。