一种用于评估南荻遗传多样性的SSR分子引物组和方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114196776A(43)申请公布日2022.03.18(21)申请号202111586404.X(22)申请日2021.12.23(71)申请人深圳技术大学地址518000广东省深圳市坪山区石井街道兰田路3002号(72)发明人孙茜廖剑锋(74)专利代理机构深圳市鼎智专利代理事务所(普通合伙)44411代理人张小晶(51)Int.Cl.C12Q1/6895(2018.01)C12Q1/6858(2018.01)C12N15/11(2006.01)G16B25/20(2019.01)G16B40/00(2019.01)权利要求书2页说明书13页附图4页(54)发明名称一种用于评估南荻遗传多样性的SSR分子引物组和方法(57)摘要本发明公布了一种用于评估南荻遗传多样性的SSR分子引物组和方法，所述SSR分子引物组包括26对南荻SSR引物，所述26对南荻SSR引物中的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如表1中SEQIDNo.1～SEQIDNo.52所示。本发明设计了能够适用于芒属植物南荻的SSR分子标记引物对，能够对不同来源地的南荻材料进行多态性分析，丰富了分析南荻遗传多样性的SSR引物。同时提供了一种评估南荻遗传多样性的方法，提高了评估程序效率，缩短了实验时间，增加评估准确性。CN114196776ACN114196776A权利要求书1/2页1.一种用于评估南荻遗传多样性的SSR分子引物组，其特征在于，所述SSR分子引物组包括26对南荻SSR引物，所述26对南荻SSR引物中的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如表1中SEQIDNo.1～SEQIDNo.52所示。2.一种用于评估南荻遗传多样性的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取不同地域南荻的DNA样本；2)以所述步骤1)中提取的南荻待测样品DNA为模板，对权利要求1所述26对SSR引物PCR扩增，得到扩增产物；3)将所述步骤2)得到的PCR扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染显色，读取电泳数据，统计条带检测结果；4)根据所述步骤3)中条带检测结果，建立二元原始数据矩阵；5)根据所述步骤4)中的二元原始数据矩阵，利用PopGenV1.32软件计算每个位点的等位基因数、每个位点的有效等位基因数、Shannon信息指数、多态性条带数、Nei's相似系数、多态性条带百分率遗传多样性参数；6)根据所述步骤4)中的二元原始数据矩阵，利用MS‑tools软件计算每个引物的多态信息量和Shannon‑Weaver多样性指数；7)根据所述步骤4)中的二元原始数据矩阵，利用软件NTSYSpc2.10e对不同地域的南荻计算遗传相似系数；8)根据所述步骤7)中的遗传相似系数，利用SAHNClustering和非加权法平均聚类法做聚类分析，构建聚类树状图。3.根据权利要求2所述的一种用于评估南荻遗传多样性的方法，其特征在于，所述建立二元原始数据矩阵的方法为：将所述步骤3)中的条带检测结果进行比对、校正，利用表格工具在相同迁移率位置上无条带出现记为“0”，有扩增条带出现记为“1”。4.根据权利要求2所述的一种用于评估南荻遗传多样性的方法，其特征在于，所述步骤2)中PCR扩增体系如下：2μl浓度为10pmol/L的模板DNA、6μl2×TSINGKEMasterMix、0.24μl浓度为10pmol/L上游引物、0.24μl浓度为10pmol/L下游引物、12μl无菌水。5.根据权利要求2或4所述的一种用于评估南荻遗传多样性的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：98℃预变性5min，94℃变性30s，50～68℃退火30s，72℃复性1min，70℃延伸5min；其中，变性、退火和复性循环30次，PCR产物4℃保存。6.根据权利要求2所述的一种用于评估南荻遗传多样性的方法，其特征在于，所述步骤1)中南荻的样本为南荻幼嫩叶片。7.根据权利要求2所述的一种用于评估南荻遗传多样性的方法，其特征在于，所述步骤1)中提取南荻DNA样本方法包括以下步骤：a)取0.3g叶脉去除的南荻幼嫩叶片，剪碎后置于无菌1.5ml第一离心管中；b)将所述第一离心管浸泡在液氮中速冻10s，向所述第一离心管内灌入1ml液氮，使用预冷冻的镊子将速冻后的所述第一离心管从液氮中取出；c)将装备在电钻夹头上的塑料研磨棒伸入1.5ml所述第一离心管内，将南荻幼嫩叶片打碎；d)向所述第一离心管中迅速加入1ml2×CTAB提取液，水浴40～50min，涡旋混匀，再于12000rpm，离心10min；2CN114196776A权利要求书2/2页e)将获取的上清液转至另一无菌的1.5ml第二离心管中；再加入与所述上清液等体积的24：1(V/V)氯仿－异戊醇，