用于马铃薯腐烂茎线虫遗传多样性分析的SSR引物组及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114231646A(43)申请公布日2022.03.25(21)申请号202210152485.0C12Q1/6858(2018.01)(22)申请日2022.02.18C12N15/11(2006.01)(71)申请人江苏师范大学地址221116江苏省徐州市铜山新区上海路101号申请人江苏徐淮地区徐州农业科学研究所（江苏徐州甘薯研究中心）(72)发明人孙厚俊马居奎谢逸萍马代夫张成玲李宗芸杨冬静唐伟陈晶伟(74)专利代理机构南京德铭知识产权代理事务所(普通合伙)32362代理人奚鎏(51)Int.Cl.C12Q1/6888(2018.01)权利要求书1页说明书9页序列表4页附图4页(54)发明名称用于马铃薯腐烂茎线虫遗传多样性分析的SSR引物组及其应用(57)摘要本发明公开了一种用于马铃薯腐烂茎线虫遗传多样性分析的SSR引物组及其应用，属于分子标记技术领域。本发明所述的SSR引物组包括9对引物，具有稳定性强、多态性高、重复性好等优点，适用于马铃薯腐烂茎线虫种群遗传结构分析，能有效对马铃薯腐烂茎线虫进行遗传多样性分析及群体聚类分析。CN114231646ACN114231646A权利要求书1/1页1.用于马铃薯腐烂茎线虫遗传多样性分析的SSR引物组，其特征在于，包括9对引物，分别为DD‑02、DD‑10、DD‑27、DD‑77、DD‑86、DD‑88、DD‑98、DD‑105、DD‑133，其序列如下所示：引物名称正向引物序列(5’‑3’)反向引物序列(5’‑3’)重复基元DD‑02ATAGACCCAGGCTCTCGGATCCCAAGGAAAGAGAGGGAGT(TTG)5DD‑10ACCTCCAGGTTGAGGGCTATGCTTCACCTAAGTCGCAACC(AC)6DD‑27TGAGCTCAGAACCAAGAGCAAGGAGAGACCATAGGAGGGC(CT)7DD‑77TGGGCTCATTTGTCTCCATTCCGAAGAATGGCAATCATTT(AT)6DD‑86CGTGCTTCAAAGAGGAATGCAGCATTGGGCCAGATGTTAC(GTG)5DD‑88TCTGGACGCAACTAAACTGGAAGGGTCTCTCGATCCGATT(CT)7DD‑98ACAGATGGCAGGAATGCAACGCGCTAGGACGAAATAGTGG(GA)6DD‑105TGCAGGTGCAGACTTTCAATTGCGGAATTTGGTTCCTTAG(TA)6DD‑133GGAGCAGTGTGTCCTCCTTCAATGGCCAATGACTGGTCTC(GAC)52.根据权利要求1所述的SSR引物组在马铃薯腐烂茎线虫遗传多样性分析中的应用，其特征在于，应用方法包括以下步骤：(1)马铃薯腐烂茎线虫群体样本的分离；(2)马铃薯腐烂茎线虫样本DNA的提取；(3)每对引物的正向引物分别加上AP接头序列，获得带有AP接头的正向引物，所述的AP接头序列为5’‑CAGTCGGGCGTCATCA‑3’；在AP接头序列引物5’端带有FAM、HEX或ROX的特异性荧光标记，获得荧光标记的AP引物；(4)以步骤(2)得到的马铃薯腐烂茎线虫DNA为模板，以步骤(3)获得的带有AP接头的正向引物、荧光标记的AP引物和反向引物，使用三引物法进行PCR扩增，获得荧光PCR产物；(5)将步骤(4)得到的荧光PCR产物进行毛细管荧光电泳检测，读取毛细管电泳数据，统计条带检测结果；(6)将步骤(5)得到的马铃薯腐烂茎线虫毛细管电泳条带信息进行遗传多样性分析。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(4)中，PCR扩增体系如下：1μL模板DNA、10μL的2×TaqPCRMasterMix、0.15μL浓度为10pmol/μL带有AP接头的正向引物、1.2μL浓度为10pmol/μL的反向引物、1.2μL浓度为10pmol/μL的荧光标记的AP引物，ddH2O补充至20μL。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(4)中，PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃末端延伸10min。5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(6)中，遗传多样性分析的方法为：利用ABI3730自动测序仪结合GeneMapperversion4.1确定微卫星等位基因；使用GenAlEx6.5和Cervus3.0.7软件统计9个位点的等位基因数、有效等位基因数、Shannon’s多样性指数、表观杂合度、预期杂合度和多态信息含量指数；利用软件Fstat2.9.3计算群体间的遗传分化系数；根据FST＝1/(4Nm+1