单叶铁线莲的组培快速繁殖方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106922527A(43)申请公布日2017.07.07(21)申请号201710126861.8(22)申请日2017.03.06(71)申请人浙江大学地址310058浙江省杭州市西湖区余杭塘路866号(72)发明人姜维梅邱英雄(74)专利代理机构杭州中成专利事务所有限公司33212代理人金祺(51)Int.Cl.A01H4/00(2006.01)权利要求书3页说明书11页附图2页(54)发明名称单叶铁线莲的组培快速繁殖方法(57)摘要本发明公开了一种单叶铁线莲的组培快速繁殖方法，利用单叶铁线莲的种子为外植体，依次进行以下步骤：种子休眠的破除，顶芽的增殖培养，将所得的丛生芽切割成单芽后重复进行增殖培养、或者将丛生芽转入生根培养基中进行下述的生根培养，叶片愈伤组织的诱导，愈伤组织的分化，体细胞胚胎发生，生根培养，移栽。本发明成功实现了单叶铁线莲的组培快繁，可以快速培育出大量幼苗，为中药材GAP种植提供一种切实可行的开发项目。CN106922527ACN106922527A权利要求书1/3页1.单叶铁线莲的组培快速繁殖方法，其特征在于利用单叶铁线莲的种子为外植体，依次进行以下步骤：1)、取材：选择单叶铁线莲的瘦果，剥离果皮，得种子；2)、种子消毒：将步骤1)所得的种子进行消毒，得消毒后种子；3)、种子休眠的破除：先将消毒后种子用抽滤灭菌后的BAP溶液、或GA3溶液浸泡22～26小时，然后用无菌水冲洗，接着播种在种子培养基上，黑暗状态下培养6～8天后转入光/暗交替培养直至顶芽长至0.5～1cm时停止培养，得无菌苗；所述种子培养基为MS+30g/L蔗糖+6.2g/L琼脂，pH5.8～6.0；BAP溶液的浓度为18～22mg/l，GA3溶液的浓度为95～105mg/l；4)、顶芽的增殖培养：将无菌苗的顶芽切下，转接于增殖培养基上进行增殖培养；所述增殖培养基为：MS基本培养基+BAP0.5～1mg/l+IAA或NAA0.05～0.1mg/l+30g/l蔗糖+6.2g/l琼脂+0.8g/lPVP，pH5.8～6.0；增殖培养的条件为：光/暗交替培养；当顶芽长成≥2cm的幼苗、且每个芽的周围有3～6个新芽出现时结束增殖培养，得丛生芽；5)、将所得的丛生芽切割成单芽后，替代步骤4)中的无菌苗的顶芽重复进行上述步骤4)；或者，将丛生芽转入生根培养基中进行步骤9)的生根培养；6)、叶片愈伤组织的诱导：将步骤3)所得的无菌苗的叶片，切去边缘和顶端后切成0.5×0.5cm，接种到愈伤组织诱导培养基Ⅰ或愈伤组织诱导培养基Ⅱ上进行诱导；愈伤组织诱导培养基Ⅰ为MS+2.4-D1mg/l+NAA1mg/l+BAP0.1mg/l+30g/l蔗糖+6.2g/l琼脂+0.8g/lPVP，pH5.8-6.0；愈伤组织诱导培养基Ⅱ为MS+BAP2mg/l+NAA0.1mg/l+30g/l蔗糖+6.2g/l琼脂+0.8g/lPVP，pH5.8-6.0；所述诱导条件为：黑暗培养2周后转入光/暗交替培养，当叶片边缘颗粒状的愈伤组织块聚集在一起直至直径达到1～1.5cm时，结束诱导培养；7)、愈伤组织的分化：将步骤6)所得的愈伤组织转移到分化培养基Ⅰ上，进行不定芽的分化；所述分化培养基为以下任意一种：MS+KT1～2mg/l+IAA0.1mg/l+30g/l蔗糖+6.2g/l琼脂+0.8g/lPVP，pH5.8～6.0；MS+BAP0.5～2mg/l+IAA0.1mg/l+30g/l蔗糖+6.2g/l琼脂+0.8g/lPVP，pH5.8～6.0；所述分化培养条件为：光/暗交替培养；当每块愈伤组织上分化形成5～9个、且长度≥2CN106922527A权利要求书2/3页2cm的幼苗时结束分化培养，形成了丛生的不定芽；8)、体细胞胚胎发生：将步骤3)所得的无菌苗的叶片在愈伤组织诱导培养基Ⅱ上进行愈伤组织的诱导，培养条件同步骤6)；将所得的愈伤组织转移到分化培养基Ⅱ上进行体细胞胚的分化培养，体细胞胚胎发生的培养条件为光/暗交替培养；分化培养基Ⅱ为MS+BAP0.5+NAA0.1mg/l+AC0.8g/l+30g/l蔗糖+6.2g/l琼脂，pH5.8-6.0；当愈伤组织块上出现向上形成芽且向下形成根的双极性体细胞胚、且芽的高度达到3-4cm和根的长度≥5cm时，结束此步骤的培养转入步骤10)；或者，当愈伤组织块上出现只向上形成芽的单极性体细胞胚、且芽的高度达到2-3cm时，结束此步骤的培养转入步骤9)；9)、生根培养：将步骤4)培养所得的幼苗、丛生芽，步骤7)愈伤组织上分化出的不定芽，步骤8)愈伤组织上分化出来的单极性体细胞胚中的至少一种转入生根培养基中进行生根培养；生根培养的条件为首先在黑暗条件下培养3～