【精选】酶的提取与分离纯化(2).ppt

第三章酶的提取与分离纯化一、电泳的基本理论1.原理:影响迁移率的因素：颗粒性质：Q越大、r越小、形状越接近球形v越快。电场强度：E越高v越快。电泳液：pH值：离pI越远v越快。（用buffer保持恒定）离子强度：离子强度越高v越低。通常缓冲液离子强度在0.02-0.2之间。电渗：在电场中液体对于固体支持物的相对移动。应避免用高电渗物质作支持介质。自由界面电泳：又称移动界面电泳指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。区带电泳:指有支持介质的电泳待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用:防止电泳过程中的对流和扩散。按支持介质种类的不同区带电泳可分为：①纸电泳：用滤纸作支持介质用于核苷酸定性定量分析。②醋酸纤维素薄膜电泳：常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白优点是简便迅速便于保存照相比纸电泳分辨率高。以上两种类型的电泳由于介质的孔径度大没有分子筛效应主要靠被分离物的电荷多少进行分离。③琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。④聚丙烯酰胺凝胶电泳：用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分辨率高。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。3.电泳常用设备（1）电泳仪：提供稳定直流电源的装置。常压电泳仪（600V）高压电泳仪（3000V）超高压电泳仪（30000V～50000V）（2）电泳槽：自由界面电泳槽管状电泳槽板状电泳槽（3）附属设备：二、聚丙烯酰胺凝胶电泳！1.原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂NN’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂和加速剂作用下聚合的。CH2=CH聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：1）化学催化系统：AP-TEMED催化剂：过硫酸铵（ammoniumpersulfateAP）加速剂：TEMED（NNN’N’-四甲基乙二胺）2）光催化系统：核黄素－光－（TEMED）催化剂:核黄素（维生素B2）引发剂:光TEMED的存在可加速聚合。凝胶浓度越大（小）孔径越小（大）可分离分子量较小（大）的颗粒。Acr与Bis的重量比应在30左右。样品2.分离效应PAGE根据其有无浓缩效应分为：连续电泳采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统不连续电泳采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系电荷效应不连续PAGE分子筛效应浓缩效应电荷效应:分离胶中蛋白质表面净电荷不同迁移率不同。分子筛效应：大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带然后再进入分离胶进行分离。不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳三、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresisSDS-PAGE）简称SDS－PAGE。是目前测定蛋白质亚基相对分子量的一种最好的办法。1.原理：SDS是种阴离子去污剂带有大量负电荷与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。SDS破坏蛋白质氢键、疏水键巯基乙醇使二硫键打开引起蛋白质构象改变使蛋白质－SDS复合物形状近似椭圆形短轴相同（1.8nm）长轴与蛋白质分子量成正比。因此蛋白质—SDS复合物在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。★2.操作：（SDS-PAGE及PAGE即变性及非变性）1）制胶:（变性：buffer中加0.4%SDS）a.分离胶：根据待分离样品的分子大小选择一定浓度的分离胶（查表）配制分离胶溶液：Acr:Bis=29:1分离胶bufferTEMEDAP水迅速倒胶加水使液面平坦室温0.5h聚合完全。b.浓缩胶：用浓缩胶buffer。插上梳子。2）样品制备：a.PAGE:样品＋样品缓冲液（蔗糖或甘油＋指示剂溴酚蓝）b.SDS-PAGE:样品＋样品缓冲液（SDS甘油巯基乙醇溴酚蓝）煮沸2-5min以除去亚稳态聚合。3）加样及电泳：S