新穿心莲内酯糖基转移酶蛋白及其编码基因与应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107267477A(43)申请公布日2017.10.20(21)申请号201710343107.XC12N15/11(2006.01)(22)申请日2017.05.16C12P17/04(2006.01)(71)申请人中国中医科学院中药研究所地址100700北京市东城区东直门内南小街16号申请人江西青峰药业有限公司(72)发明人陈士林尹青岗孙伟曾君南韩小燕黄铭坤宋驰冷梁师玉华(74)专利代理机构北京海虹嘉诚知识产权代理有限公司11129代理人高芬芳(51)Int.Cl.C12N9/10(2006.01)C12N15/54(2006.01)权利要求书1页说明书6页序列表4页附图5页(54)发明名称新穿心莲内酯糖基转移酶蛋白及其编码基因与应用(57)摘要本发明公开了新穿心莲内酯糖基转移酶蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的新穿心莲内酯糖基转移酶蛋白是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对新穿心莲内酯具有催化活性的由a)衍生的蛋白质。本发明基于穿心莲高通量测序的相关结果，用反向遗传学的方法找到并鉴定新穿心莲内酯合成的最后一步关键酶ApUGT73AU1，填补新穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯苷生物合成途径的终端空白，为进一步生物合成新穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯苷提供了糖基转移酶蛋白及其编码序列。CN107267477ACN107267477A权利要求书1/1页1.一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对新穿心莲内酯具有催化活性的由a)衍生的蛋白质。2.权利要求1所述蛋白的编码基因。3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下1)或2)或3)所示：1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性的DNA分子。4.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。5.扩增权利要求2或3所述编码基因全长或其任一片段的引物对，所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。6.权利要求1所述的蛋白在作为新穿心莲内酯糖基转移酶中的应用。7.权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述编码基因在催化新穿心莲内酯苷元生成新穿心莲内酯中的应用。2CN107267477A说明书1/6页新穿心莲内酯糖基转移酶蛋白及其编码基因与应用技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其涉及新穿心莲内酯糖基转移酶蛋白及其编码基因与应用。背景技术[0002]穿心莲是应用广泛的重要药用植物，其提取物具有清热解毒、消炎、消肿止痛作用。其主效成分——穿心莲内酯已被制作为多种非处方药，而另一种主效成分——新穿心莲内酯单体还未成药，因此新穿心莲内酯的生物合成途径的研究将具有重要的医学意义和经济价值。[0003]穿心莲属于爵床科，该属约包括20种，其中药用的主要是穿心莲(Andrographispaniculata(Bm.F)Nees)，它被认为是苦味之王，被中国、印度、泰国和马来西亚等国家广泛应用。穿心莲提取物在治疗咽喉炎、流感和上呼吸道感染效果良好，并且还对疟疾和HIV具有治疗作用。[0004]现在中国食品药品监督管理局(SFDA)批准的穿心莲药品，常见的有穿王消炎胶囊、穿心莲内酯软胶囊和穿心莲内酯滴丸，主要利用的为穿心莲内酯(andrographolide)。新穿心莲内酯(neoandrographolide)与穿心莲内酯同为穿心莲的主效成分，它们具有同样的二萜骨架结构，但是新穿心莲内酯比穿心莲内酯多了一个葡萄糖基，少了两个羟基(图1)。新穿心莲内酯结构上的特征使得它可能具有穿心莲内酯相似或不同的药理作用。[0005]同穿心莲内酯药理作用相似，体内外实验表明新穿心莲内酯在抗炎、抗肿瘤、降血压、治疗冠心病等方面具有显著作用。陈咏梅还发现新穿心莲内酯在治疗肺部肿瘤方面更有效果；新穿心莲内酯可能在治疗老年性痴呆(Alzhemier氏病)起到重要作用，穿心莲内酯药理研究中还未有此方面的报到。[0006]因此，新穿心莲内酯成为穿心莲类新药的研究热点，对其生物合成途径的研究将具有重要的研究意义和潜在的巨大经济价值。[0007]新穿心莲内酯糖基转移酶催化了其合成途径的最后一步反应，此酶的鉴定将为新穿心莲内酯生物合成途径的整体解析起到极大的促进作用，并为其生物合成提供理论