用于筛选莲雾低温胁迫下内参基因的引物及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107475416A(43)申请公布日2017.12.15(21)申请号201710859453.3(22)申请日2017.09.21(71)申请人福建省农业科学院果树研究所地址350013福建省福州市晋安区新店镇埔党(72)发明人许家辉魏秀清章希娟许玲(74)专利代理机构福州元创专利商标代理有限公司35100代理人蔡学俊(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)C12N15/29(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表10页附图3页(54)发明名称用于筛选莲雾低温胁迫下内参基因的引物及其应用(57)摘要本发明提供筛选莲雾低温胁迫下内参基因的引物及其应用，所述引物为：正向引物5'-CCTGGCCTCTATGATCTTATCC-3'，反向引物5'-CAGGCATCATGTGCTTTG-3'。本发明利用qRT-PCR检测7个候选内参基因ACT-7、GAPDH、UBQ、α-TUB、CYP20-1、EF-2和APRT-5在莲雾果实发育和低温胁迫下的表达水平，通过geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder软件进行基因稳定性评价，结果表明低温胁迫下表达最稳定的内参基因CYP20-1，这不仅解决了现有莲雾定量PCR检测中没有内参基因的现状，也为后续的基因表达工作奠定基础。CN107475416ACN107475416A权利要求书1/1页1.用于筛选莲雾低温胁迫下内参基因的引物，其特征在于：所述引物为：正向引物5'-CCTGGCCTCTATGATCTTATCC-3'；反向引物5'-CAGGCATCATGTGCTTTG-3'。2.如权利要求1所述引物筛选获得内参基因为亲环蛋白基因。3.权利要求1所述的引物在低温胁迫下进行莲雾相关基因实时荧光定量PCR检测时应用。2CN107475416A说明书1/5页用于筛选莲雾低温胁迫下内参基因的引物及其应用技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及用于筛选莲雾低温胁迫下内参基因的引物及其应用。背景技术[0002]莲雾〔Syzygium.samarangense(BI.)Merr.etPerry〕为桃金娘科（Mytaceae）蒲桃属（Syzygium）常绿乔木，是典型热带果树。莲雾果实营养丰富，具止泻、镇痛、抗菌、消炎（Tina等2011）等功效，且色泽艳丽，清脆爽口，受消费者喜爱，在我国适宜种植区发展迅速，是重要的热带特色果类。在生产上，莲雾果实品质不稳和冬季低温寒害是阻碍莲雾产业发展的两大突出问题，亟需解决。长期以来，一般都是采用优化栽培措施、改善栽培条件来提高莲雾果实品质及耐寒性，但品种的优质、抗寒遗传特性才是起决定作用的因素。因此，研究莲雾果实品质及对寒冻害的抗逆机制，解析其果实品质形成的整个代谢网络及响应低温的基因表达调控网络，有针对性地发掘相关基因加以利用，对莲雾分子育种具有重要意义。[0003]基因表达与转录组分析是阐明植物复杂的代谢途径及逆境胁迫生理响应的重要手段。实时荧光定量PCR具灵敏度高、重复性好、特异性强和高通量等特点，被广泛应用于基因的表达及转录组分析等研究中。RNA质量、反转录效率、内参基因的选择等因素影响着qRT-PCR的准确性和可靠性。其中，选择稳定表达的内参基因是保证基因表达分析结果准确可靠的重要前提条件。理想的内参基因应在所有的细胞中或各种生理状态下均能稳定低表达，但大量研究表明传统的看家基因在不同组织类型或试验条件下稳定性不一，因此，根据不同试验材料及条件，筛选合适的内参基因或同时使用多个内参基因，才能保障目标基因表达定量的准确性及可靠性。目前尚未见关于莲雾内参基因筛选的报道，本发明选取7个常用的内参基因，利用qRT-PCR技术对其在不同试验条件下的表达稳定性进行评价，以期筛选出在低温胁迫下稳定表达的内参基因，为后续的基因表达工作奠定基础。发明内容[0004]本发明的目的在于提供用于筛选莲雾低温胁迫下内参基因的引物及其应用，本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：利用qRT-PCR技术对7个莲雾内参基因在低温胁迫条件下表达稳定性进行检测，通过geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder共4个软件进行基因稳定性评价，综合软件分析结果，筛选出在低温胁迫下稳定表达的内参基因。获得稳定表达内参基因一个：CYP20-1，其引物对如下所示：正向引物5'-CCTGGCCTCTATGATCTTATCC-3'反向引物5'-CAGGCATCATGTGCTTTG-3'所述的内参基因引物在莲雾低温胁迫下实时荧光定量PCR时进行应用。[0005]本发明的优点在于：本发明提供了一个莲雾内