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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108504623A(43)申请公布日2018.09.07(21)申请号201810398409.1(22)申请日2018.04.28(71)申请人大连普瑞康生物技术有限公司地址116023辽宁省大连市高新技术产业园区七贤岭礼贤街32号(72)发明人刘汉石赵德修刘雅萍(74)专利代理机构北京智为时代知识产权代理事务所(普通合伙)11498代理人王加岭杨静(51)Int.Cl.C12N5/04(2006.01)C12N13/00(2006.01)C12P1/00(2006.01)C12R1/91(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图1页(54)发明名称一种水母雪莲高产黄酮细胞系及其制备方法(57)摘要本发明提供了一种水母雪莲高产黄酮细胞系的制备方法及培养基,其制备方法为:采用水母雪莲种子诱导愈伤组织;将获得的愈伤组织进行固体继代培养;用目测法继代培养的愈伤组织中直接挑选总黄酮的含量高的细胞系;转到液体培养,再从液体转入到固体培养,如此不断地反复筛选、继代多次后得到成长迅速、总黄酮的含量较高产细胞系。用本发明制备的细胞系和培养基,细胞在光照悬浮培养温度25℃左右,其细胞生长速率可达45g-50g干重/升/月,黄酮类化合物的含量可达培养物干重的12%。CN108504623ACN108504623A权利要求书1/1页1.一种水母雪莲高产黄酮细胞系的制备方法,其特征在于,其包括如下步骤:S1、采用水母雪莲种子诱导愈伤组织;S2、将步骤S1获得的愈伤组织进行固体继代培养;S3、用目测法从步骤S2中的愈伤组织中直接挑选总黄酮的含量高的细胞系;S4、将步骤S3获得的细胞系从固体培养转到液体培养,再从液体转入到固体培养,如此不断地反复筛选、继代多次后得到成长迅速、总黄酮的含量较高的细胞系。2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述方法还包括:S5、将步骤S4获得的所述较高产细胞系作60Coγ-射线照射诱变,之后采用小细胞团筛选法,获得总黄酮高产量的细胞系。3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤S1包括将水母雪莲种子消毒后,去掉外壳和种皮,然后接在含3mg/L的2,4-二氯苯氧基乙酸的培养基中,25℃暗培养,30d后从种子胚轴和子叶边缘能够生长出颗粒状愈伤组织,每2周继代一次。4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述消毒为先用70-75%乙醇消毒1分钟,无菌水冲洗,再用2%的次氯酸钠溶液振荡消毒60-62min,再用无菌水冲洗。5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤S2中愈伤组织的培养采用的培养基中添加有0.2mg/L的苄氨基腺嘌呤,2mg/L萘乙酸进行继代培养。6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,在所述步骤S2中,采用58.4μmol·m-2·s-1日光灯照射,25℃下培养,每隔2周继代1次。7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,在所述步骤S4中,所述继代为12-30次。8.根据权利要求1-7中任一项所述的制备方法,其特征在于,采用的培养基的配方为:大量元素:NH4NO31200mg/L,KNO31200mg/L,CaCl2·2H2O300mg/L,MgSO4·7H2O370mg/L,KH2PO4300mg/L;微量元素:H3BO36.2mg/L,MnSO4·4H2O22.3mg/L,ZnSO4·7H2O10mg/L,Na2MnO4·2H2O0.25mg/L,CuSO4·5H2O0.025mg/L,CoCl2·6H2O0.025mg/L,FeSO4·7H2O22mg/L,Na2-EDTA·2H2O30mg/L;有机成分:肌醇100mg/L,烟酸0.5mg/L,盐酸吡哆醇0.5mg/L,盐酸硫胺素0.5mg/L,甘氨酸2mg/L,蔗糖30g/L,琼脂7g/L,pH为5.8,其中,液体培养时不添加琼脂,在所述步骤S1中所用的培养基中为所述大量元素减半的培养基。9.根据权利要求1-8中任一项制备方法制备的水母雪莲高产黄酮细胞系在用于制备黄酮类化合物中的应用。10.一种用于水母雪莲高产黄酮细胞系的培养基,其特征在于,所述培养基的配方为:含有1200mg/L的NH4NO3,1200mg/L的KNO3,300mg/L的CaCl2·2H2O,370mg/L的MgSO4·7H2O,300mg/L的KH2PO4;6.2mg/L的H3BO3,22.3mg/L的MnSO4·4H2O,10mg/L的ZnSO4·7H2O,0.25mg/L的0.25mg/L的Na2MnO4·2H2O,0.025mg/L的CuSO4·5H2O,0.025mg/L的CoCl2·6H2O,22mg/L的FeSO4·7H2O,30mg/L的N