利用线粒体分子标记鉴定樱桃实叶蜂的方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111197092A(43)申请公布日2020.05.26(21)申请号202010047419.8(22)申请日2020.01.16(71)申请人四川省农业科学院植物保护研究所地址610066四川省成都市静居寺路20号(72)发明人刘虹伶刘旭陈松陈庆东蒲德强刘月悦李超杨永利陈倩颖胡伟易春燕张翠翠(74)专利代理机构北京东方盛凡知识产权代理事务所(普通合伙)11562代理人张雪(51)Int.Cl.C12Q1/6888(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表1页附图1页(54)发明名称利用线粒体分子标记鉴定樱桃实叶蜂的方法及其应用(57)摘要本发明公开了用于鉴定樱桃实叶蜂的线粒体分子标记，包括以下引物：F：5’-AGGAGCCCCCGATATAGCTT-3’，R：5’-GCTGCCGTAAAATAAGCTCGA-3’。还公开了利用线粒体分子标记鉴定樱桃实叶蜂的方法，包括：步骤1：提取供试样品DNA；步骤2：采用线粒体分子标记对供试样品的模板DNA进行PCR，获取PCR扩增产物；步骤3：所得PCR扩增产物进行凝胶电泳，对电泳检测结果通过分析基本核心SSR结果，确定供试样品的品种。该线粒体分子标记挑选的引物具有扩增稳定、条带清晰易判读、多态性高、重复性好，可有效用于樱桃实叶蜂鉴定、DNA指纹图谱构建及遗传多样性评价及系统发育研究领域。CN111197092ACN111197092A权利要求书1/1页1.用于鉴定樱桃实叶蜂的线粒体分子标记，其特征在于，包括以下引物：F：5’-AGGAGCCCCCGATATAGCTT-3’，R：5’-GCTGCCGTAAAATAAGCTCGA-3’。2.利用线粒体分子标记鉴定樱桃实叶蜂的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：提取供试样品中的DNA；步骤2：采用权利要求1所述的线粒体分子标记对供试样品的模板DNA进行PCR，获取PCR扩增产物；步骤3：对所得PCR扩增产物进行凝胶电泳，对电泳检测结果通过分析基本核心SSR结果，确定供试样品的品种。3.如权利要求2所述的利用线粒体分子标记鉴定樱桃实叶蜂的方法，其特征在于，步骤1中，所述供试样品为来自于北京、河北、河南、山西、浙江省、四川省不同地区的樱桃实叶蜂。4.如权利要求2所述的利用线粒体分子标记鉴定樱桃实叶蜂的方法，其特征在于，步骤2中，扩增体系20μL，包括：5×FastPfuBuffer4μL、2.5mMdNTPs2μL、5μM引物各0.8μL、DNA聚合酶0.4μL、DNA模板10ng，加水补充至20μL；扩增程序：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min，10℃保存。5.如权利要求2所述的利用线粒体分子标记鉴定樱桃实叶蜂的方法，其特征在于，步骤3中，采用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测。6.一种如权利要求1所述的线粒体分子标记在辅助樱桃实叶蜂鉴定、DNA指纹图谱构建及遗传多样性评价与系统发育研究中的应用。7.一种如权利要求2-5任一项所述的方法在辅助樱桃实叶蜂鉴定、DNA指纹图谱构建及遗传多样性评价与系统发育研究中的应用。2CN111197092A说明书1/5页利用线粒体分子标记鉴定樱桃实叶蜂的方法及其应用技术领域[0001]本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种利用线粒体分子标记鉴定樱桃实叶蜂的方法及其应用。背景技术[0002]樱桃实叶蜂属膜翅目、叶蜂科，是危害樱桃的重要害虫，主要以幼虫取食叶片危害，低龄幼虫食害叶肉，仅残留表皮，幼虫稍大后取食叶片呈不规则缺刻与孔洞，严重发生时将叶吃的残缺不全，甚至仅残留叶脉，从而影响树体生长及树势。虽然樱桃实叶蜂对樱桃危害严重，但是目前采用的预防和防治方式主要是通过化学药剂进行处理，化学药剂的使用可以达到一定的效果，但是长期使用容易造成化学药物残留，并且樱桃实叶蜂还可能产生抗药性，目前为止没有很好的预防方式。[0003]众所周知，生物预防病虫害是一种有效且环保的方式，但是一直以来虽然樱桃实叶蜂常见于我国北京、河北、河南、山西、浙江省、四川省，但是对于樱桃实叶蜂自身的遗传信息的研究却少有研究和报道，使得如何利用生物信息防治樱桃实叶蜂的危害受到极大限制。[0004]基于樱桃实叶蜂对于樱桃的严重危害，严重影响樱桃种植业的发展，开展樱桃实叶蜂的品种鉴定、指纹图谱构建、遗传多样性评价及系统发育关系研究均有重要意义，然而上述工作都依赖于多态性高，重复性好、标记稳定、带型清晰易判读的分子标记的开发。基于此，发明人首次对樱桃实叶蜂线粒体全基因组进行了测序，并对其生物学特性进行了分析，并进行了系统发育分析，以确定其在叶蜂家族Tenthredinoidea中的