一种雷公藤甲素半抗原及其制备方法与应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107698653A(43)申请公布日2018.02.16(21)申请号201710940761.9(22)申请日2017.10.11(71)申请人中国农业科学院蜜蜂研究所地址100093北京市海淀区香山北沟1号(72)发明人杨术鹏李熠周金慧张金振金玥赵文王鹏袁媛(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人王文君王璐(51)Int.Cl.C07J73/00(2006.01)C07K14/765(2006.01)C07K14/77(2006.01)C07K16/44(2006.01)权利要求书1页说明书7页附图3页(54)发明名称一种雷公藤甲素半抗原及其制备方法与应用(57)摘要本发明涉及食品安全与检测，具体公开了一种雷公藤甲素半抗原及其制备方法与应用。所述雷公藤甲素半抗原的分子结构式如式Ⅰ所示。本发明还公开了使用所述雷公藤甲素半抗原进行全抗原的合成，并进行多克隆抗体的制备以及检测试剂盒研发。本发明的雷公藤甲素多克隆抗体及其试剂盒可用于有毒蜂蜜、中药、生物基质中剧毒物质雷公藤甲素及雷公藤二萜物质的检测分析。CN107698653ACN107698653A权利要求书1/1页1.一种雷公藤甲素半抗原，其特征在于，分子结构式如式Ⅰ所示：2.权利要求1所述雷公藤甲素半抗原的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)称取100mg雷公藤甲素溶于10mL无水二氯甲烷中，向上述溶液中加入300mg丁二酸酐，100mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)，反应体系室温搅拌12小时，后将反应体系倒入分液漏斗，用稀盐酸洗涤三次，收集有机相，干燥浓缩；(2)以乙酸乙酯：石油醚＝1:1体系作为展开剂柱色谱分离得白色目标化合物；上述步骤中涉及到的质量和体积可等比例扩大或缩小。3.一种雷公藤甲素抗原，其特征在于，由权利要求1所述的雷公藤甲素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)或鸡卵清白蛋白(OVA)。4.权利要求3所述的雷公藤甲素抗原的制备方法，其特征在于，采用活化酯法将载体蛋白偶联于权利要求1所述雷公藤甲素半抗原的羧基碳上。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)称取20mg权利要求1所述的雷公藤甲素半抗原溶解于500μLDMF中，得到半抗原溶液；(2)在上述半抗原溶液，加入30mg二环己基碳二亚胺(DCC)和20mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，300rpm室温反应5h；(3)称取60mg载体蛋白溶于10mLPBS缓冲液中，得到蛋白溶液；(4)将步骤(2)的液相逐滴加入到步骤(3)制备的蛋白溶液中，边滴加边搅拌；上述步骤中涉及到的质量和体积可等比例扩大或缩小。6.一种雷公藤甲素抗体，其特征在于，由权利要求3所述的雷公藤甲素抗原免疫动物后制备得到。7.根据权利要求6所述的雷公藤甲素抗体，其特征在于，所述抗体为雷公藤甲素多克隆抗体。8.权利要求6或7所述的抗体在检测雷公藤二萜类物质中的应用。9.一种酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求6或7所述的抗体。10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括包被原、包被液、封闭液、生物酶标记的第二抗体、洗涤液、显色剂和终止液。2CN107698653A说明书1/7页一种雷公藤甲素半抗原及其制备方法与应用技术领域[0001]本发明涉及食品安全与检测，具体地说，涉及一种雷公藤甲素半抗原及其制备方法与应用。背景技术[0002]雷公藤甲素(Triptolide，TPL)是从传统中药雷公藤中提取出来的环氧二萜内酯类化合物，是雷公藤的主要有效成分之一。具有免疫调节、抗炎、抗生育及抗肿瘤等多种生物活性，临床使用广泛，但雷公藤甲素治疗窗窄，不合理使用常常导致人发生中毒反应，危害人类健康。[0003]近年来，我国南方地区陆续爆发多起蜂蜜中毒致人死亡的恶性事件，如2014年的福建泰宁和2015年的湖北恩施村民食野生蜂蜜意外中毒。通过对事发当地的调研和实验室分析发现蜜蜂采集雷公藤花粉产生蜂蜜，人们食用蜂蜜之后便出现了中毒反应。经检测这些蜂蜜中含有大量的雷公藤甲素，其含量介于200-1500μg/kg。因此，检测蜂蜜等食品中雷公藤甲素很有必要。[0004]目前，检测雷公藤甲素的方法大多是采用高效液相色谱或者液相串联质谱技术检测。通常这些检测方法需要昂贵的分析仪器，对检测样本的预处理也较为繁琐，难以适用于中毒反应的快速诊断和推广。因此，为了检测生物样本和蜂蜜中的雷公藤甲素，急需开发一种较为灵敏、快速、可靠的快检方法。[0005]免疫分析方法是基于抗原和抗体之间的特异性结合而建立起来的一种生物分析方法。与传统的理化分析方法相比，免疫分析具有操作简便、分析时间较短、灵敏度高、