一种半抗原及其在检测雷公藤乙素和雷公藤甲素方面的应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111440185A(43)申请公布日2020.07.24(21)申请号202010244574.9C07K1/02(2006.01)(22)申请日2020.03.31C07K1/113(2006.01)G01N33/68(2006.01)(71)申请人中国农业科学院蜜蜂研究所G01N33/531(2006.01)地址100093北京市海淀区香山北沟1号(72)发明人杨术鹏李熠周金慧傅怡张金震金钥杨宇辉黄京平袁媛赵文(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人陈征(51)Int.Cl.C07D493/22(2006.01)C07K14/765(2006.01)C07K14/77(2006.01)C07K16/16(2006.01)权利要求书2页说明书8页附图3页(54)发明名称一种半抗原及其在检测雷公藤乙素和雷公藤甲素方面的应用(57)摘要本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种半抗原及其在检测雷公藤乙素和雷公藤甲素方面的应用。所述半抗原具有如下结构：其完全抗原不但可将雷公藤乙素的化学结构暴露出来，还可将雷公藤乙素和雷公藤甲素共有的化学结构暴露出来作为抗原决定簇，其抗体可同时识别雷公藤甲素(IC50可达1.2ng/mL)和雷公藤乙素(IC50可达0.86ng/mL)。这为高灵敏度、高特异性抗体的制备奠定了基础，为建立快速、简便、价廉、灵敏、特异的雷公藤甲素及雷公藤乙素的检CN111440185A测方法提供了新手段。CN111440185A权利要求书1/2页1.一种半抗原，其特征在于，具有如下结构：2.权利要求1所述的半抗原的制备方法，其特征在于，反应路径如下：具体为：将雷公藤乙素与琥珀酸酐在55～65℃下反应得到。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述反应在在吡啶中进行；所述雷公藤乙素与所述琥珀酸酐的质量比为10：(3～5)；所述反应在避光条件下进行；所述反应在220～260rpm下进行7～9h。4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，在所述反应后，还包括纯化过程，所述纯化过程具体为：用乙酸乙酯萃取反应产物后，用稀盐酸洗涤有机相，在有机相干燥浓缩后，经C18色谱柱分离纯化，即得。5.一种人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述的半抗原与载体蛋白偶联后得到；其中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白中的一种或几种。6.权利要求5所述的人工抗原的制备方法，其特征在于，通过碳二亚胺、活泼酯法或混合酸酐法使所述半抗原与载体蛋白偶联。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，包括：(1)称取摩尔比为1：(1.8～2.2)：(1.8～2.2)的所述半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺，用N,N-二甲基甲酰胺溶解后得到反应液，将所述反应液在350～400rpm下室温避光反应4～6h，离心取上清，获得半抗原活化液；按终浓度为4.5～5.5mg/mL将所述载体蛋白溶于磷酸盐缓冲液中，得到载体蛋白溶液；(2)将所述半抗原活化液滴入所述载体蛋白溶液中，使所述半抗原与载体蛋白的摩尔比达到(18～22):1，4℃搅拌反应过夜。8.一种抗体，其特征在于，以权利要求5所述的人工抗原为免疫原，免疫动物制备得到。9.权利要求1所述的半抗原或权利要求5所述的人工抗原在以下任一方面的应用：①在制备抗雷公藤乙素和雷公藤甲素特异性抗体中的应用；②在检测抗雷公藤乙素和雷公藤甲素特异性抗体中的应用。10.权利要求8所述的抗体在以下任一方面的应用：(1)在检测雷公藤乙素和雷公藤甲素药物中的应用；2CN111440185A权利要求书2/2页(2)在制备雷公藤乙素和雷公藤甲素的免疫层析试纸条中的应用；(3)在制备雷公藤乙素和雷公藤甲素的酶联免疫分析试剂盒中的应用；(4)在检测有毒蜂蜜中的应用。3CN111440185A说明书1/8页一种半抗原及其在检测雷公藤乙素和雷公藤甲素方面的应用技术领域[0001]本发明涉及生物化工技术领域，具体涉及一种半抗原及其在检测雷公藤乙素和雷公藤甲素方面的应用。背景技术[0002]雷公藤乙素(Tripdiolide)是从中药植物雷公藤中提取的一种活性物质，属于雷公藤二萜类物质。药理学研究结果表明雷公藤乙素具有良好的抗炎、抗肿瘤和免疫调节等活性，但是该化合物由于具有较强的肾脏毒性和胃肠道毒性，且治疗剂量与毒性剂量相近，导致其治疗的安全窗口较窄，限制了其在临床医学上的应用。但是由于雷公藤在治疗类风湿性关节炎、红斑狼疮和小儿紫癜等方面疗效确切，雷公藤提取物已经作为中药得到广泛应用。雷公藤乙素作为雷公藤中药提取物的活性成分之一，准确测定其含量对于评估药物的有效性和安全性尤为关键。[000