基因表达和基因重组.ppt

基因重组和基因工程
GeneticRecombinationandGeneticEngineering概论基因重组：不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA分子。重组DNA技术发展史pSC101pSC101人体生长激素释放激素(SS)第一节DNA的重组DNARecombinationDNA重组发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。二、细菌的基因转移与重组可接合质粒如F因子(Ffactor)（二）转化作用例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。（三）转导作用λ噬菌体的生活史第二节重组DNA技术相关概念
DNA克隆
工具酶
目的基因
基因载体
基本原理
重组DNA技术与医学的关系一、重组DNA技术相关概念技术水平：分子克隆(molecularclone)
即DNA克隆
细胞克隆
个体克隆（动物或植物）DNA克隆
应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等（二）工具酶重组DNA技术中常用的工具酶限制性核酸内切酶作用
与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；
第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；
第四个字母代表株；
用罗马数字表示发现的先后次序。Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)BamHⅠ同功异源酶

来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。（三）目的基因按照人的愿望设计和建造非天然的基因表达体系。cDNA：
经反转录合成的、与mRNA互补的DNA链。

基因组DNA：
代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。（四）基因载体宿主细胞载体的选择标准存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子。
具有自我复制功能。
带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物。
经改造后具有多克隆位点。
举例：pBR322质粒抗Amp多种酶切口λ噬菌体DNA改造系统
λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）
EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）粘性质粒(cosmid)酵母人工染色体
(yeastartificialchromosome,YAC)
细菌人工染色体
(bacterialartificialchromosome,BAC)
动物病毒DNA改造的载体
（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）二、重组DNA技术基本原理以
质
粒
为
载
体
的
DNA
克
隆
过
程（一）目的基因的获取*化学合成法获取目的基因组织或细胞染色体DNAcDNA文库
以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA，与适当载体连接后转入受体菌，即获得cDNA文库。mRNA的提取与纯化cDNA聚合酶链式反应（PCR）目的基因（三）外源基因与载体的连接BamHⅠ切割反应不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接2.平端连接
适用于：限制性内切酶切割产生的平端
粘端补齐或切平形成的平端目的基因3.同聚物加尾连接
在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。5´
3´4.人工接头(linker)连接
由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。人工接头及其应用受体菌条件
安全宿主菌
限制酶和重组酶缺陷
处于感受态(competent)（五）重组体的筛选

1.直接选择法
(1)抗药性标记选择
(2)标志补救(markerrescue)
(3)分子杂交法
原位杂交
Southern印迹

2.免疫学方法
如免疫化学方法及酶免检测分析等(插入失活法)
抗药性标记选择α互补α互补的检测
原位杂交Southern印迹鸡的β肌球蛋白的克隆和检出重组DNA技术操作过程可形象归纳为重组DNA技术操作的主要步骤表达体系的建立
表达载体的构建
受体细胞的建立
表达产物的分离纯化1.原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）
标准：选择标志 强启动子
翻译调控序列 多接头克隆位点
E.coli表达体系