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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109270182A(43)申请公布日2019.01.25(21)申请号201811434717.1(22)申请日2018.11.28(71)申请人海峡两岸农产品检验检疫技术厦门中心地址361000福建省厦门市海沧区建港路2165号生物实验楼(72)发明人严丽娟徐敦明赖国银薛晓锋张洁林立毅张志刚张峰(74)专利代理机构厦门市精诚新创知识产权代理有限公司35218代理人刘小勤(51)Int.Cl.G01N30/02(2006.01)G01N30/06(2006.01)权利要求书2页说明书6页附图5页(54)发明名称一种麦卢卡蜂蜜的鉴别方法(57)摘要本发明涉及一种麦卢卡蜂蜜的鉴别方法,该方法采用基于液相色谱/高分辨质谱的代谢物组学技术对国产蜂蜜和麦卢卡蜂蜜的代谢组进行全面获取与分析,结合多元统计分析方法,通过建立PLS-DA模型,实现对蜂蜜蜜种是否为麦卢卡蜂蜜的鉴别。本发明所述的麦卢卡蜂蜜的鉴别方法,可以有效避免主观因素的干扰,而且灵敏度和准确性显著提升。而且,运用液相色谱/高分辨质谱对蜂蜜样本进行检测,前处理较为简单,可以同时处理数十个样品,分析通量大大提高。所建数据库可以进行扩展,随着样本信息的不断加入,PLS-DA鉴别模型的准确度将会进一步提高,从而实现鉴别方法自身在使用过程中不断自动优化,越测越准确。CN109270182ACN109270182A权利要求书1/2页1.一种麦卢卡蜂蜜的鉴别方法,包括以下步骤:步骤A1:收集麦卢卡商品化样本作为麦卢卡蜂蜜样本集S1;步骤A2:收集不同种类的国产蜂蜜作为非麦卢卡蜂蜜样本集S2;步骤A3:将麦卢卡蜂蜜样本集S1中的样本和非麦卢卡蜂蜜样本集S2中的样本进行前处理,提取小分子代谢物,并分别利用液相色谱/高分辨质谱采集代谢组数据;步骤A4:对原始数据进行处理,导入文件后进行峰提取、峰对齐、未知物的检测、未知物的分组、未知物组成预测和搜库,通过分析序列中质控样品的基峰离子色谱图,确保仪器保留时间和离子强度的重现性;在数据可靠的情况下,进行LoessQC矫正减小仪器长时间进样导致的保留时间漂移和信号衰减,同时计算质控样品中代谢特征峰RSD值,去除其中RSD大于20%的特征峰,将离子对数据表导入到Simca-p软件,基于经过标准化处理的纯麦卢卡蜂蜜样本的强度积分相对数据矩阵与类别变量进行PLS-DA回归建模,得到鉴别模型;步骤A5:测定未知样本的液相色谱/高分辨质谱代谢组数据,并将该数据代入已建立的鉴别模型,判定未知样本是否为麦卢卡蜂蜜:若未知样本符合已建立的鉴别模型,则判定为麦卢卡蜂蜜;否则,判定为非麦卢卡蜂蜜。2.根据权利要求1所述的麦卢卡蜂蜜的鉴别方法,其特征在于:所述步骤A3中样本进行前处理的方法包括样本溶解、除杂以及检测样本制备。3.根据权利要求2所述的麦卢卡蜂蜜的鉴别方法,其特征在于:所述前处理的方法包括:称取融化的蜂蜜样本于10mL离心管中,加入HCl溶液定容至10mL,涡旋混合至蜂蜜样本完全溶解,高速离心,分取5mL上清液过固相萃取柱,用3mL水淋洗,再用3mL甲醇洗脱,经过离心浓缩仪浓缩后,用重溶液重新溶解。4.根据权利要求3所述的麦卢卡蜂蜜的鉴别方法,其特征在于:蜂蜜样本融化的方法为:对无结晶的蜂蜜样本,直接将其搅拌均匀备用;对有结晶的蜂蜜样本,在密闭情况下,水浴温热,振荡,待样本全部融化后搅匀,迅速冷却至室温。5.根据权利要求3所述的麦卢卡蜂蜜的鉴别方法,其特征在于:所述蜂蜜样本的质量为1.8-2.2克;任选的,所述HCl溶液的摩尔浓度为0.01-0.02mol/L,或者pH值为1.9-2.1;任选的,所述高速离心的转速为10000-120000rpm,离心时间为10-20min;任选的,所述固相萃取柱型号为WatersPrimeHLB,60mg,3mL;任选的,所述离心浓缩仪浓缩的倍数为5-10倍;任选的,所述重溶液为0.1重量%甲酸的水溶液和乙腈的混合溶液,其中甲酸的水溶液与乙腈的体积比=7/3。6.根据权利要求4所述的麦卢卡蜂蜜的鉴别方法,其特征在于:所述水浴温热的温度为30-50℃。7.根据权利要求1所述的麦卢卡蜂蜜的鉴别方法,其特征在于:所述步骤A3中液相色谱/高分辨质谱的分析条件包括:采用液相色谱和高分辨质谱仪联用系统,在质谱的正离子和负离子两种扫描模式下,获得完整的代谢指纹谱,以保证最终结果的完整性和准确性。8.根据权利要求1或7所述的麦卢卡蜂蜜的鉴别方法,其特征在于:所述液相色谱的分析条件包括:HSST3色谱柱,1.8μm,2.1mmi.d.×100mm;进样体积为10μL;柱温50℃,流动相:A为0.1重量%甲酸的水溶液,B为含0.1重量%甲酸的甲醇溶液,流速0.4mL/m