利用液相色谱串联质谱测定蜂蜜中中蜂MRJP1蛋白含量的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110596261A(43)申请公布日2019.12.20(21)申请号201910749459.4G01N30/86(2006.01)(22)申请日2019.08.14G01N33/68(2006.01)(71)申请人中国农业科学院蜜蜂研究所地址100093北京市海淀区香山北沟1号(72)发明人杨术鹏李熠丛晓蕾周金慧张金震金玥(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人黄爽(51)Int.Cl.G01N30/02(2006.01)G01N30/06(2006.01)G01N30/34(2006.01)G01N30/36(2006.01)G01N30/72(2006.01)权利要求书2页说明书12页序列表2页附图5页(54)发明名称利用液相色谱串联质谱测定蜂蜜中中蜂MRJP1蛋白含量的方法(57)摘要本发明提供一种利用液相色谱串联质谱测定蜂蜜中中蜂MRJP1蛋白(王浆主蛋白1)含量的方法，所述方法包括：特征肽段的选择，制作标准曲线，样品前处理，液相色谱分离以及串联质谱检测定量等步骤。本发明提供的蜂蜜中中蜂MRJP1含量的检测方法，具有较高的准确度、精确度和灵敏度，并且稳定性强，适合于蜂蜜中中蜂MRJP1的准确定量。该方法可用于中蜂蜜真实性评价，辅助鉴别蜂蜜是否掺假,对于维护蜂蜜消费行业健康发展和蜂蜜消费者的权益意义重大。CN110596261ACN110596261A权利要求书1/2页1.利用液相色谱串联质谱测定蜂蜜中中蜂MRJP1蛋白含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、提取标准中蜂蜂蜜样品中的蛋白质，进行SDS-PAGE电泳，将MRJP1蛋白对应的条带切胶回收，然后酶解MRJP1蛋白，酶解产物除盐后，用0.1％v/v的甲酸水溶液复溶，然后进行液相色谱串联质谱检测；B、根据液相色谱串联质谱检测结果，筛选出MRJP1蛋白的特征肽段并测序，然后人工合成所述特征肽段及其稳定同位素内标肽段；C、配制不同浓度的所述特征肽段的标准品溶液；D、向标准品溶液中加入稳定同位素内标肽段混匀，然后进行液相色谱串联质谱检测；E、根据标准品溶液的浓度以及特征肽段/稳定同位素内标肽段的峰面积比绘制标准曲线；F、对待测蜂蜜样品进行前处理：先将蜂蜜样品溶解于去离子水或PBS缓冲溶液中，离心收集上清，即为蛋白溶液；将蛋白溶液用胰蛋白酶水解，酶解产物除盐后作为待测样本；G、用待测样本替代步骤D中的标准品溶液，采用相同方法进行液相色谱串联质谱检测；H、根据待测样本的检测结果，对照标准曲线，获得待测样本中特征肽段的浓度，从而实现对蜂蜜样品中中蜂MRJP1蛋白的定量检测；其中，所述特征肽段为：IMDANVNDLILNTR。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A包括以下子步骤：a1、蜂蜜中蛋白质的提取：将蜂蜜与去离子水或PBS缓冲溶液按照1:1体积比溶解，离心10min，收集上清液至10KD分子通量的超滤管中，以5000g离心力离心，使蛋白溶液浓缩至最小体积，然后收集上清液，作为蛋白提取液，并测定提取液中总蛋白浓度；a2、蛋白质的SDS-PAGE分析：将蛋白提取液进行SDS-PAGE分析，用12％浓缩胶和10％分离胶将MRJP1与其它蛋白分离，然后用考马斯蓝染色；a3、MRJP1蛋白的酶解：从电泳凝胶上切下MRJP1蛋白对应的条带，置于离心管中，并用加入脱色液没过凝胶条，旋转进行脱色至无色；弃去脱色液并加入乙腈使切下的凝胶条带脱水，上下颠倒使其均匀反应，吸走乙腈并蒸发浓缩干燥；然后加入100mMDTT溶液浸没胶条使其吸胀，在室温反应60min，吸干多余的DTT，再加入100mMIAA溶液在室温下暗反应60min；吸干多余的IAA，向干燥的凝胶块中加入用40mMNH4HCO3溶解的胰蛋白酶浸没胶条，37℃酶切过夜，其中，胰蛋白酶与MRJP1蛋白的质量比为1:50；然后加入0.1％v/v甲酸水溶液终止酶切反应，加入含0.1％v/v甲酸的70％v/v乙腈水溶液浸没胶条进行萃取，静置10-20min，将萃取液转移至新的离心管中，重复一次萃取，合并两次萃取液，除盐后将样品进行真空干燥，然后用0.1％v/v甲酸水溶液复溶，进行液相色谱串联质谱检测。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤D和G中采用UHPLC-QExactiveplus进行液相色谱串联质谱检测；(1)液相色谱条件如下：色谱柱：为C18柱；流动相组成：流动相A为0.1％v/v甲酸水溶液，流动相B为含0.1％v/v甲酸的乙腈；梯度洗脱条件为：0-0.5min，5％的B；0.5-1.0min，5-15％的B；1.0-6.5min，15-40％的B；6.5-7.0min，40-95％的B；7.0-8.5m