液相色谱串联质谱定量中蜂蜜MRJP2的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110850002A(43)申请公布日2020.02.28(21)申请号201911261727.4(22)申请日2019.12.10(71)申请人中国农业科学院蜜蜂研究所地址100093北京市海淀区香山北沟1号(72)发明人杨术鹏李熠周金慧丛晓蕾张金震金钥杨宇辉黄京平袁媛赵文(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人黄爽(51)Int.Cl.G01N30/02(2006.01)G01N30/06(2006.01)G01N30/72(2006.01)G01N30/86(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表3页附图3页(54)发明名称液相色谱串联质谱定量中蜂蜜MRJP2的方法(57)摘要本发明提供一种液相色谱串联质谱定量中蜂蜜MRJP2的方法。本发明针对中蜂蜜筛选出其中王浆主蛋白2（MRJP2）的特征肽段，并开发液相色谱串联质谱的定量方法，所述方法包括：筛选特征肽段，制作标准曲线，样品前处理，液相色谱分离以及串联质谱检测，软件定量肽段等步骤。本发明提供的中蜂蜜的MRJP2的定量方法，具有较高的准确度、精确度和灵敏度，并且稳定性强，适用于准确定量中蜂蜜的MRJP2。可用于辅助中蜂蜜真实性评价。此外该定量方法对保护蜂蜜消费者的权益和维护蜂产品行业的健康发展具有重要现实意义。CN110850002ACN110850002A权利要求书1/1页1.液相色谱串联质谱定量中蜂蜜MRJP2的方法，其特征在于，所述方法提供用于质谱法准确定量中蜂蜜MRJP2的特征肽段，含有以下特征肽段：特征肽段1：IVNNDFNFNDVNFR；特征肽段2：MTSNTFDYDPR。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对蜂蜜样品进行前处理的步骤，前处理使用的试剂包括：(1)提取缓冲液：0.01MPBS，pH7.4；(2)胰蛋白酶液20ng/μL，溶剂为40mM碳酸氢氨溶液；和/或(3)特征肽段1、2的标准品。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、配制含有固定浓度的稳定同位素内标肽段的不同浓度的特征肽段标准品溶液，进入质谱检测并绘制标准曲线；B、待测蜂蜜样品的前处理：提取蜂蜜中的蛋白质，用胰蛋白酶液对样品蛋白进行酶切，对酶解产物除盐；C、向待测样本中添加稳定同位素内标肽段使其浓度与步骤A中的浓度相同，采用相同方法进行液相色谱串联质谱检测；D、对照标准曲线，获得待测样本中特征肽段的浓度，从而实现对MRJP2的定量检测。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤A和C中采用三重四级杆或QExactiveplus液质联用仪进行液相色谱串联质谱检测。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述定量特征肽段IVNNDFNFNDVNFR在质谱中所产生的检测信号的母离子具有864.41044的质荷比；包含质荷比为535.29883、m/z1172.54797的子离子，其允许偏差应在10ppm以内。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述稳定同位素内标肽段为：IVNNDFNFNDVNFR*，其中，R*表示精氨酸中的碳置换为13C，氮置换为15N；所述稳定同位素内标肽段在质谱中产生的检测信号的母离子为m/z:869.41458，包含质荷比为1035.48755、1182.55713的子离子。7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤A得到的标准曲线为Y=0.001118X-0.01915，R2=0.9988，其中，Y为特征肽段/稳定同位素内标肽段的峰面积比，X为特征肽段的浓度。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，MRJP2的线性检测范围为10-1000ng/mL，最低检出限为5ng/mL。2CN110850002A说明书1/7页液相色谱串联质谱定量中蜂蜜MRJP2的方法技术领域[0001]本发明涉及食品检测领域，具体地说，涉及一种液相色谱串联质谱定量中蜂蜜MRJP2的方法。背景技术[0002]中蜂蜜，也称土蜂蜜，是由我国本土蜜蜂—中华蜜蜂采集蜜源植物而酿制的蜂蜜。当前，我国中蜂存量约300万群，主要分布在我国南方省市的山区。意大利蜜蜂主要采用追花逐蜜的转场养殖方式进行单一花种蜜的生产；而中蜂主要是定地饲养生产百花蜂蜜。中蜂蜜的产量远低于意蜂蜜，从而导致中蜂蜜的市场价格较高，大约是意蜂蜜的5-10倍。不良企业为了追逐高额利润，往往会采用意蜂蜜冒充中蜂蜜，或者在中蜂蜜中勾兑意蜂蜜进行掺假，甚至掺入廉价的果葡糖浆，严重扰乱了蜂蜜的正常生产及销售秩序。因此，亟需开发出科学有效的中蜂蜜真假识别技术。[0003]王浆主蛋白2(majorroyaljellyprotein2，MRJP2)是蜂蜜中的主要的蛋白质之一。意蜂和中蜂M