液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP3的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110850001A(43)申请公布日2020.02.28(21)申请号201911260275.8(22)申请日2019.12.10(71)申请人中国农业科学院蜜蜂研究所地址100093北京市海淀区香山北沟1号(72)发明人杨术鹏李熠周金慧丛晓蕾张金震金钥杨宇辉黄京平袁媛赵文(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人黄爽(51)Int.Cl.G01N30/02(2006.01)G01N30/06(2006.01)G01N30/72(2006.01)G01N30/86(2006.01)权利要求书1页说明书9页序列表3页附图2页(54)发明名称液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP3的方法(57)摘要本发明提供一种液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP3的方法。本发明针对意蜂蜜筛选出其中王浆主蛋白3（MRJP3）的特征肽段，并开发液相色谱串联质谱的定量方法，所述方法包括：筛选特征肽段，制作标准曲线，样品前处理，液相色谱分离以及串联质谱检测，软件定量肽段等步骤。本发明提供的意蜂蜜中MRJP3的定量方法，具有较高的准确度、精确度和灵敏度，且稳定性强，适用于准确定量意蜂蜜中MRJP3。可用于辅助意蜂蜜真实性评价。此外，该定量方法对保护蜂蜜消费者的权益和维护蜂产品行业的健康发展具有重要现实意义。CN110850001ACN110850001A权利要求书1/1页1.液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP3的方法，其特征在于，所述方法包括质谱法检测意蜂蜜中MRJP3的特征肽段，含有以下特征肽段：特征肽段1：LTVAGESFTVK，用于定量；特征肽段2：GGPLLRPYPDWSFAK，用于定性。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对蜂蜜样品进行前处理的步骤，前处理使用的试剂包括：(1)提取缓冲液：0.01MPBS，pH7.4；(2)胰蛋白酶液20ng/μL，溶剂为40mM碳酸氢氨溶液；(3)特征肽段1、2的标准品。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、配制含有固定浓度的稳定同位素内标肽段的不同浓度的特征肽段标准品溶液，进入质谱检测并绘制标准曲线；B、待测蜂蜜样品的前处理：提取蜂蜜中的蛋白质，用胰蛋白酶液对样品蛋白进行酶切，对酶解产物除盐；C、向待测样本中添加稳定同位素内标肽段使其浓度与步骤A中的浓度相同，采用相同方法进行液相色谱串联质谱检测；D、对照标准曲线，获得待测样本中特征肽段的浓度，从而实现对MRJP3的定量检测。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤A和C中采用三重四级杆或QExactiveplus液质联用仪进行液相色谱串联质谱检测。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，特征肽段LTVAGESFTVK在质谱中所产生的检测信号的母离子具有576.31897的质荷比；包含质荷比为838.43048、767.39343的子离子，其允许偏差在10ppm以内。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述稳定同位素内标肽段为：LTVAGESFTVK*，其中，K*表示赖氨酸中的碳置换为13C，氮置换为15N；所述稳定同位素内标肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子具有580.32607的质荷比；子离子包含质荷比为846.44409、775.40686的子离子。7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤A得到的标准曲线为Y=0.02712X-0.7996，R2=0.9983，其中，Y为特征肽段/稳定同位素内标肽段的峰面积比，X为特征肽段的浓度。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，MRJP3的线性检测范围为5-1000ng/mL，最低检出限为2ng/mL。2CN110850001A说明书1/9页液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP3的方法技术领域[0001]本发明涉及食品检测领域，具体地说，涉及一种液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP3的方法。背景技术[0002]蜂蜜是蜜蜂采集蜜源植物的花蜜或蜜露与其分泌物混合，经过一段时间酿制后形成的一类具有甜味食品。蜂蜜作为传统的天然食品，具有美容、养颜、安神等保健功能，深受百姓喜爱。蜂蜜的生产劳动强度高、周期长、产量易受到蜜源、天气等因素影响，从而导致蜂蜜的生产成本较高，总产量有限，导致市场上的蜂蜜供不应求。一些不法企业为了追逐巨额利润，在蜂蜜的生产、加工、销售等环节，通过掺入蔗糖、转化糖、果糖、葡萄糖、果葡糖浆等制造掺假蜂蜜，严重扰乱了蜂蜜的正常生产及销售秩序。因此加强对蜂蜜真伪鉴别技术的研究是目前亟需开展的工作。[0003]王浆主蛋白3（majorroyaljellyprotein3，MRJP3）是王浆主蛋白大家族中的一类蛋白质，是蜂蜜中含量比较丰富的蛋白质。