一种液相色谱串联质谱定量检测中蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111157635A(43)申请公布日2020.05.15(21)申请号201911368845.5(22)申请日2019.12.26(71)申请人中国农业科学院蜜蜂研究所地址100093北京市海淀区香山北沟1号(72)发明人杨术鹏李熠丛晓蕾周金慧张金震金钥黄京平杨宇辉袁媛赵文(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人陈征(51)Int.Cl.G01N30/02(2006.01)G01N30/06(2006.01)G01N30/72(2006.01)G01N30/88(2006.01)权利要求书1页说明书6页序列表3页附图3页(54)发明名称一种液相色谱串联质谱定量检测中蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的方法(57)摘要本发明提供一种液相色谱串联质谱定量检测中蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的方法，包括：筛选特征肽段，制作标准曲线，样品前处理，液相色谱分离以及串联质谱检测，软件定量肽段等步骤；所述特征肽段包括特征肽段1：MLNDSVFAFSR和特征肽段2：IYTHDIPETYNIVR。本发明所提出的中蜂蜜α-葡萄糖苷酶的定量方法，具有较高的准确度、精确度和灵敏度，并且稳定性强，适用于准确定量中蜂蜜中α-葡萄糖苷酶，可用于辅助中蜂蜜真实性评价。该定量方法对保护蜂蜜消费者的权益和维护蜂产品行业的健康发展具有重要现实意义。CN111157635ACN111157635A权利要求书1/1页1.一种液相色谱串联质谱定量检测中蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，包括：通过液相色谱串联质谱法检测待测蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的特征肽段，所述特征肽段包括肽段:特征肽段1：MLNDSVFAFSR，特征肽段2：IYTHDIPETYNIVR。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在检测之前用检测试剂盒处理所述待测蜂蜜，所述检测试剂盒由以下成分组成:(1)提取缓冲液0.01MPBS，pH7.4；(2)胰蛋白酶20ng/μL，溶剂为40mM碳酸氢氨；(3)特征肽段1、2的标准品。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：A、配制含有固定浓度的稳定同位素内标肽段的不同浓度的特征肽段标准品溶液，进入液相色谱串联质谱检测并绘制标准曲线；B、提取所述待测蜂蜜中的蛋白质，用胰蛋白酶进行酶切，对酶解产物除盐后作为待测样本；C、向所述待测样本中添加所述稳定同位素内标肽段使其浓度与步骤A中的浓度相同，采用步骤A中相同方法进行液相色谱串联质谱检测；D、对照步骤A所得标准曲线，获得所述待测样本中特征肽段的浓度，从而实现对α-葡萄糖苷酶的定量检测。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤A和C中采用三重四级杆或QExactiveplus液质联用仪进行液相色谱串联质谱检测。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，以MLNDSVFAFSR为定量特征肽段，其在质谱中所产生的检测信号的母离子具有643.81353的质荷比，包含质荷比为1042.49523、803.42539的子离子，其允许偏差应在10ppm以内。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述稳定同位素内标肽段为：MLNDSVFAFSR*，其中，R*表示精氨酸中的碳置换为13C，氮置换为15N；所述稳定同位素内标肽段在质谱中产生的检测信号的母离子为m/z:648.81766，包含质荷比为1052.50350、637.33319的子离子。7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤A得到的标准曲线为Y＝0.01238X-0.3023，R2＝0.9988，其中，Y为特征肽段/稳定同位素内标肽段的峰面积比，X为特征肽段的浓度；检测范围为5-1000ng/mL，最低检出限为2ng/mL。2CN111157635A说明书1/6页一种液相色谱串联质谱定量检测中蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的方法技术领域[0001]本发明涉及食品检测领域，具体为一种液相色谱串联质谱定量检测中蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的方法，该方法适用于中蜂蜜的真实性的鉴别与评价。背景技术[0002]中蜂蜜，亦称之为土蜂蜜，是由中华蜜蜂采集蜜源植物而酿制的蜂蜜。中蜂比意蜂个头小，背部黑，行动更敏捷，且两个种群之间没有姻缘关系，无法杂交繁殖，中蜂蜜的产量远低于意蜂蜜，从而导致中蜂蜜的市场价格较高，大约是意蜂蜜的5-10倍。不良商贩为了追逐高额利润，往往会采用意蜂蜜冒充中蜂蜜，或者在中蜂蜜中勾兑意蜂蜜进行掺假，甚至掺入廉价的果葡糖浆。[0003]α-葡萄糖苷酶，是蜂蜜中的主要的蛋白质之一，广泛存在于多种蜂蜜中，但其在不同种蜂蜜如中蜂蜜、意蜂蜜中的氨基酸序列有所不同。中蜂α-葡萄糖苷酶在不同蜜种、不同蜜源中的含量稍有不同，但其含量相对恒定，若是掺入了糖浆等外源性物质，则