一种重组PCV2病毒样颗粒蜂胶疫苗及其制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112010949A(43)申请公布日2020.12.01(21)申请号202010764917.4C12N1/21(2006.01)(22)申请日2020.08.03A61K39/12(2006.01)A61P31/20(2006.01)(71)申请人山东绿都生物科技有限公司C12R1/19(2006.01)地址256600山东省滨州市经济开发区绿都生物工程高科技园申请人山东省滨州畜牧兽医研究院(72)发明人沈志强曲光刚武曰星王长江董林程立坤郭广君(74)专利代理机构北京智为时代知识产权代理事务所(普通合伙)11498代理人王加岭(51)Int.Cl.C07K14/01(2006.01)C12N15/34(2006.01)C12N15/70(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表3页附图5页(54)发明名称一种重组PCV2病毒样颗粒蜂胶疫苗及其制备方法(57)摘要本发明提供一种重组PCV2病毒样颗粒疫苗制备方法，所述的制备方法是通过对猪圆环病毒2型Cap蛋白进行优化，并利用重组无内毒素大肠杆菌高密度发酵，获得高表达量的猪圆环病毒2型病毒样颗粒。本发明的猪圆环病毒2型Cap蛋白，其相比原始序列增加了一对二硫键，并对相应的序列片段进行优化，试验结果表明，通过所述序列的优化增加了病毒样颗粒疫苗的免疫原性，试验结果表明，通过高密度发酵与高效表达实现了Cap蛋白的高效表达，10倍浓缩表达菌可获得1:64‑1:128的琼扩效价；相比未优化的序列和其他佐剂的疫苗。CN112010949ACN112010949A权利要求书1/1页1.一种猪圆环病毒2型Cap蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNo：1所示。2.一种编码权利要求1所述的猪圆环病毒2型Cap蛋白的核酸分子，其特征在于，其碱基序列如SEQIDNO.2所示。3.一种含有权利要求2所述的核酸分子的载体，所述载体为重组表达载体或重组克隆载体，所述载体为由所述核酸分子插入pET28a载体得到。4.一种含有如权利要求3所述的重组表达载体的重组菌。5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，由所述的重组表达载体转化大肠杆菌得到，优选的，所述大肠杆菌为无致病性内毒素的大肠杆菌ClearColiTMBL21（DE3）。6.一种制备PCV2病毒样颗粒蜂胶疫苗的方法，其特征在于，包括：培养所述的重组菌，从培养产物中分离纯化得到权利要求1所述的Cap蛋白。7.根据权利要求6所述的制备PCV2病毒样颗粒蜂胶疫苗的方法，其特征在于，包括：（1）将SEQIDNo：2所述的编码所述猪圆环病毒2型Cap蛋白的核酸分子插入到pET28a表达载体，得到重组载体；（2）将重组载体转化无致病性内毒素的大肠杆菌ClearColiTMBL21（DE3），构建重组表达菌；（3）应用高密度发酵与高效表达技术，使用市售培养基，对PCV2Cap蛋白进行高效可溶表达；（4）收集培养发酵的菌，分离纯化获得PCV2Cap病毒样颗粒；（5）以所述PCV2病毒样颗粒为活性成分，制备PCV2Cap病毒样颗粒疫苗。8.根据权利要求7所述的方法，所述分离纯化包括：所收集的培养发酵的菌，高压均质破碎后，利用亲和层析柱纯化PCV2Cap病毒样颗粒。9.根据权利要求7所述方法制备得到的PCV2病毒样颗粒疫苗，所述的PCV2病毒样颗粒疫苗中PCV2Cap病毒样颗粒为活性成分或者活性成分之一。10.根据权利要求7所述方法制备得到所述的PCV2病毒样颗粒在制备预防和/或治疗PCV2引发的疾病的药物和或疫苗中的应用。11.一种重组PCV2病毒样颗粒疫苗制备使用的佐剂是经纯化的天然佐剂蜂胶，其使用量为5-10mg/ml干物质。12.按照本制备方法制备的疫苗既可以用于猪圆环病毒2型病的免疫预防，又可以用于猪圆环病毒2型病的紧急防治。2CN112010949A说明书1/7页一种重组PCV2病毒样颗粒蜂胶疫苗及其制备方法[0001]技术领域：本发明属于分子生物学领域，涉及一种重组PCV2病毒样颗粒蜂胶疫苗及其制备方法，尤其涉及，一种利用优化的PCV2Cap蛋白基因和无致病性内毒素的大肠杆菌高密度发酵与高效表达技术实现高产量、低成本制备PCV2病毒样颗粒蜂胶疫苗的方法、以及一种安全性更高、免疫效果更好的PCV2病毒样颗粒蜂胶疫苗，既可以用于猪圆环病毒2型病免疫预防，又可以用于猪圆环病毒2型病紧急防治。[0002]背景技术：猪圆环病毒病（PCVD）是猪圆环病毒2型（PCV2）引起的一种重要传染病，该病毒是一种小的致病性的单链DNA病毒，与猪皮炎与肾病综合征、先天性震颤、后期流产和渗出性皮炎等疾病密切相关，给全球养猪业造成了严重的经济损失。2009-2012年间，我国由PCV2感染所