一种PCV2 Cap蛋白病毒样颗粒的制备方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115725610A(43)申请公布日2023.03.03(21)申请号202211434633.4A61K39/39(2006.01)(22)申请日2022.11.16A61P31/20(2006.01)(71)申请人山东省农业科学院畜牧兽医研究所地址250100山东省济南市历城区工业北路202号(72)发明人时建立李俊张成鑫李琛刘畅刘玉伟吴晓燕徐绍建韩红(74)专利代理机构济南泉城专利商标事务所37218专利代理师牛芳(51)Int.Cl.C12N15/34(2006.01)C12N15/70(2006.01)A61K39/12(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表（电子公布）附图3页(54)发明名称一种PCV2Cap蛋白病毒样颗粒的制备方法(57)摘要本发明属于分子生物学技术领域，提供了一种PCV2Cap蛋白病毒样颗粒的制备方法：（1）人工合成密码子优化后的PCV2Cap蛋白的编码基因；（2）对含有密码子优化后的PCV2Cap蛋白基因的大肠杆菌进行诱导表达并裂解，离心后获得裂解液；（3）将裂解液纯化获得PCV2Cap蛋白溶液；（4）将PCV2Cap蛋白溶液进行透析以组装VLP。所述PCV2Cap蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本发明提供的方法能够提高Cap蛋白在大肠杆菌原核表达系统中的表达水平，体外组装获得的病毒样颗粒与自然存在PCV2粒子大小大致相同；且其对PCV2特异性抗体具有良好的免疫活性。CN115725610ACN115725610A权利要求书1/1页1.一种PCV2Cap蛋白病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）人工合成密码子优化后的PCV2Cap蛋白的编码基因；（2）对含有密码子优化后的PCV2Cap蛋白编码基因的大肠杆菌进行诱导表达并裂解，离心后获得裂解液；（3）将裂解液纯化获得PCV2Cap蛋白溶液；（4）将PCV2Cap蛋白溶液进行透析以组装VLP；步骤（4）中，透析的缓冲液配方为：Tris50mM，NaCl500mM，EDTA5mM，NaH2PO450mM，Na2HPO450mM，L‑精氨酸300mM，谷胱甘肽1.23g/L，氧化型谷胱甘肽0.245g/L，β‑巯基乙醇781.3mg/L，聚乙二醇0.03%，甘油5%，Tween800.03%，调节pH至8.0。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，PCV2Cap蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，PCV2Cap蛋白基因的编码基因如SEQIDNO:2所示。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，诱导表达的条件为：以浓度为0.2‑1.2mM的IPTG在20‑37℃下诱导3‑8h。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，诱导表达的条件为：以浓度为1.0mM的IPTG在28℃下诱导7h。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，裂解液纯化的方法为Ni‑NTA亲和层析。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，Ni‑NTA亲和层析的步骤为：将裂解液与Ni‑NTA亲和层析胶混合装入层析柱，使液体流出；以平衡缓冲液洗涤后，以咪唑含量递增的洗脱液依次洗脱，收集、合并含有目的蛋白的洗脱液，获得PCV2Cap蛋白溶液。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述平衡缓冲液的配方为：NaCl300mM，NaH2PO450mM，Tris10mM，咪唑20mM，调节至pH8.0；所述洗脱液A的配方为：Tris50mM，NaCl150mM，咪唑40mM；所述洗脱液B的配方为：Tris50mM，NaCl150mM，咪唑80mM；所述洗脱液C的配方为：Tris50mM，NaCl150mM，咪唑200mM。9.一种如权利要求1‑8任一所述的制备方法获得的PCV2Cap蛋白病毒样颗粒。10.一种如权利要求9所述的PCV2Cap蛋白病毒样颗粒在制备PCV2疫苗中的应用。2CN115725610A说明书1/5页一种PCV2Cap蛋白病毒样颗粒的制备方法技术领域[0001]本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种PCV2Cap蛋白病毒样颗粒的制备方法。背景技术[0002]猪圆环病毒2型（Porcinecircovirustype2,PCV2）是作为猪圆环病毒病（PCVAD）的主要病原能够引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）等多种传染病。PCV2是一种单股环状DNA病毒，属于圆环病毒科圆环病毒属，PCV2粒子为二十面体结构，直径约为17nm，其最外层的衣壳结构由60个Cap蛋白组成。PCV2能够感染多种抗原递呈细胞（APC）并在其中繁