一种有机醇氧化酶的制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107988179A(43)申请公布日2018.05.04(21)申请号201711415915.9(22)申请日2017.12.25(71)申请人苏州旷世骏弛生物科技有限公司地址215500江苏省苏州市常熟经济技术开发区四海路11号(72)发明人刘喜朋(51)Int.Cl.C12N9/04(2006.01)C12N15/70(2006.01)权利要求书1页说明书3页序列表1页附图1页(54)发明名称一种有机醇氧化酶的制备方法(57)摘要本发明公开了一种有机醇氧化酶的制备方法，包括以下步骤：1）设计合成嗜热微生物Aeropyrumpernix有机醇氧化酶基因，并插入pET28表达载体，构建DNA连接酶的重组表达质粒；2）重组表达热稳定性有机醇氧化酶；3）嗜热微生物Aeropyrumpernix有机醇氧化酶亲和纯化；4）检测嗜热微生物Aeropyrumpernix有机醇氧化酶活性温度依赖性。本发明中制备的醇氧化酶的酶活性最优pH为7.0，温度为50度，热稳定性为70度半衰期10小时，可以用于酶法制备有机醛。CN107988179ACN107988179A权利要求书1/1页1.一种有机醇氧化酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：步骤一、设计合成嗜热微生物Aeropyrumpernix有机醇氧化酶基因，并插入pET28表达载体，构建DNA连接酶的重组表达质粒；重组热稳定性有机醇氧化酶N端带有来源于pET28载体的6个连续组氨酸亲和纯化标签，用于固定化镍离子亲和层析纯化；步骤二、重组表达热稳定性有机醇氧化酶；将嗜热微生物Aeropyrumpernix有机醇氧化酶重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到热稳定性有机醇氧化酶重组表达菌株；将表达菌株培养至OD600=0.6，加入0.5mM诱导剂IPTG，在20℃温度下培养12小时，诱导热稳定性有机醇氧化酶表达；嗜热微生物Aeropyrumpernix有机醇氧化酶重组蛋白的氨基酸序列（氮端→碳端）如SEQIDNO:1所示；SEQIDNO:11MVDFVFPRRIVYNESLPRALETLLGDKGVKHVLVVTDGKVAAMSWFKEAVEHVASLGVEV61CIFDGVTPEPEFDVGDAIASEARRCRAEAIVAVGGGSVIDAAKAGFVKFVRPDADLEGLA121PFNYLGLEDSGIVLVAVPTTSGTGSDASYGIVLTKRVNGGREKIAVGSYEVVPYASILDP181SITLGMPERLTVGTAVDALAHSVEAIASTNANPLSDALAAKAAEIVFRRLPEVVNDPGNY241DARAEMHIAATMAGMAFTNSGLGLAHAIAHPLGARLGTHHGATVGMVLPHVVRFNESRSD301YARRKYWELKLLLESLLGLEERGSLADHIEELYARVGQPTRVRELAGIERERYLTLADEV361AEAAFRDPELAFNPVMPTMEDVKTLLYNMY步骤三、嗜热微生物Aeropyrumpernix有机醇氧化酶亲和纯化；将步骤二诱导后的大肠杆菌离心收集后，菌体重新悬浮于蛋白裂解液；超声波破碎菌体，离心收集含有嗜热微生物Aeropyrumpernix有机醇氧化酶的菌体裂解上清液；利用固定化镍离子亲和纯化树脂纯化热稳定性有机醇氧化酶；步骤四、检测嗜热微生物Aeropyrumpernix有机醇氧化酶活性温度依赖性；利用丁醇作为底物，加入嗜热微生物Aeropyrumpernix有机醇氧化酶，测定酶活性与温度依赖性。2CN107988179A说明书1/3页一种有机醇氧化酶的制备方法技术领域[0001]本发明涉及一种有机醇氧化酶的制备方法。背景技术[0002]目前有机醛药物中间体的制备多采用化学催化法，副产物多，分离纯化困难，污染大。在日益强调环保的形式已越来越不适合我国药物中间体产业的发展。在这样的形式下，采用生物酶催化法制备有机醛日益成为主要工艺。目前应用的利用将有机醇氧化成有机醛的生物酶的没特性不太好，特别是耐受有机溶剂的能力与热稳定性都比较差。[0003]目前使用的有机醇氧化酶来源于常温微生物，其只能在30-40度具有最高活性，高温容易失活，不便常温运输储存。发明内容[0004]本发明的目的在于提供一种有机醇氧化酶的制备方法，旨在针对现有有机醇氧化酶热稳定性差的缺陷，开发出的有机醇氧化酶来自于嗜热微生物Aeropyrumpernix，并经过基因改造，使得其在50-55度的温度范围内，能够发挥最高活性，并在高温中长期稳定。[0005]为了实现上述目的，本发明的技术方案是设计一种有机醇氧化酶的制备方法，包括以下步骤：步