一种镰刀菌单端孢霉烯族A类毒素的分子鉴定方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102443590A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102443590A(43)申请公布日2012.05.09(21)申请号201010506095.6(22)申请日2010.10.09(71)申请人华中农业大学地址430070湖北省武汉市洪山区狮子山街1号(72)发明人廖玉才王建华李和平张静柏黄涛(74)专利代理机构武汉宇晨专利事务所42001代理人王敏锋(51)Int.Cl.C12N15/31(2006.01)C12N15/11(2006.01)C12Q1/68(2006.01)C12Q1/04(2006.01)权利要求书1页说明书8页序列表2页附图1页(54)发明名称一种镰刀菌单端孢霉烯族A类毒素的分子鉴定方法(57)摘要本发明属于植物检验检疫技术领域，具体地涉及一种镰刀菌单端孢霉烯族A类毒素的分子鉴定方法。其特征是，针对单端孢霉烯A类毒素，通过Tri13基因信息设计一对特异性引物，从产镰刀菌A类毒素的镰刀菌中分离得到T-2毒素的特异性片段(其长度为470bp)，而不产镰刀菌A类毒素的镰刀菌中不能扩增到该特异片段，采用PCR反应，利用琼脂糖凝胶电泳检测产物，直接根据产物片段的有无及大小，即可确定某一镰刀菌是否产T-2毒素。本发明可用于谷物、饲料和食品安全中镰刀菌单端孢霉烯族A类毒素的检测。CN1024359ACCNN110244359002443607A权利要求书1/1页1.一种镰刀菌毒素T-2的基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示，序列全长为470bp。2.用于扩增权利要求1所述的基因片段的引物，其核苷酸序列分别如下所示P1：CGGAGGTTTCGACACAACAAGTA；P2：CTTCTCMCTGTTGTTTRACGG。3.一种镰刀菌单端孢霉烯族A类毒素的分子鉴定方法，其步骤包括：(1)从被测的生物材料中抽提总DNA，得到DNA样品；(2)用权利要求2中P1和P2所示的引物对步骤(1)所述的DNA样品进行PCR扩增，得到如序列表SEQIDNO：1所示的基因片段；(3)用步骤(2)得到的基因片段，检测所述的生物材料中是否存在所述的镰刀菌单端孢霉烯族A类毒素，其中步骤(2)所述的PCR扩增步骤包括：1)扩增反应体系：在20ulPCR反应体系中，含有约80ng模板DNA，2ul10×PCR缓冲液，2ul1.25mMdNTPs，0.5ul引物P1(10μM)，0.5ul引物P2(10μM)和1UTaqDNA聚合酶；2)PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃40s，33个循环；最后72℃延伸8min；3)电泳检测：反应完成后，取4ulPCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统中紫外灯下照相，根据扩增产物的有无和大小判定结果，其中步骤1)的缓冲液组成如下：20mMTri-HCl，pH8.4，200mMKCl，100mM(NH4)2SO4，20mMMgSO4。4.权利要求3所述的方法在检测镰刀菌毒素中的应用，其中包括在检测谷物籽粒、饲料或食品中的镰刀菌毒素中的应用。5.权利要求1所述的基因片段在检测镰刀菌毒素中的应用。6.权利要求2所述的引物在鉴定镰刀菌产毒类型中的应用，其中包括在在检测谷物籽粒、饲料或食品中的镰刀菌毒素中的应用。2CCNN110244359002443607A说明书1/8页一种镰刀菌单端孢霉烯族A类毒素的分子鉴定方法技术领域[0001]本发明属于植物检验检疫技术领域，具体地涉及一种镰刀菌单端孢霉烯族A类毒素的分子鉴定方法。背景技术[0002]由镰刀菌引起的赤霉病(Fusariumheadblightorscab)是世界范围内危害小麦、大麦、玉米等作物的一种重要病害，不仅严重影响作物产量，而且镰刀菌可以产生多种对人畜有毒害作用的单端孢霉烯族毒素，使粮食或饲料的品质降低。镰刀菌毒素稳定性高、不易降解，可随食品、饲料加工过程进入食物链，进而威胁人畜健康。这些毒素可抑制真核生物细胞蛋白质合成，破坏人和动物的免疫系统，中毒后常伴有呕吐、腹泻、头晕等症状，有的毒素甚至可能致癌。单端孢霉烯族毒素是最重要的镰刀菌毒素，主要包括A、B两类。T-2毒素属A类单端孢霉烯毒素，是最受关注的镰刀菌毒素，具有很大的威胁，被认为是一种真正的生化武器。在小麦、玉米等粮食或饲料中T-2毒素的检出率非常高。产T-2毒素的镰刀菌主要有FusariumPoae，Fusariumsporotrichioides，Fusariumkyushuense，Fusariumlangsethiae4种。其中，Fusariumpoae和Fusariumsporotrichioides在世界各地均有分布，但Fusariumpoae中只有一部分菌株产T-2毒素。之