一种冬虫夏草原草粉的双重PCR鉴真方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN103233062A*(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103233062103233062A(43)申请公布日2013.08.07(21)申请号201210506713.6(22)申请日2012.12.03(71)申请人中国食品发酵工业研究院地址100027北京市朝阳区霄云路32号申请人玉树藏族自治州三江源药业有限公司(72)发明人程池扎西才吉李辉姚粟刘洋白飞荣(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12Q1/04(2006.01)权权利要求书1页利要求书1页说明书3页说明书3页附图2页附图2页(54)发明名称一种冬虫夏草原草粉的双重PCR鉴真方法(57)摘要本发明公开了一种冬虫夏草原草粉的双重PCR鉴真方法。其技术方案是以冬虫夏草原草粉基因组DNA为模板，采用本发明设计的PCR引物，进行一次单管双重PCR反应，同时扩增冬虫夏草菌种及其寄主蝠蛾的特征性持家基因，实际扩增片断分别为320bp和136bp，通过琼脂糖凝胶电泳检测，确定产品的真实性。本发明可特异性识别冬虫夏草原草粉，只需DNA提取、PCR扩增和电泳检测三步即可完成对样品的真实性检测，操作简单、易于掌握、准确性高。CN103233062ACN10326ACN103233062A权利要求书1/1页1.一种冬虫夏草原草粉的鉴真方法，其特征在于：经过一次简单的单管双重PCR同时检测冬虫夏草菌种和寄主蝠蛾特征性持家基因。2.按照权利要求1所述的冬虫夏草原草粉鉴真方法，其特征在于：用于检测冬虫夏草菌种和寄主蝠蛾特征性持家基因的引物分别为：冬虫夏草菌种特征性持家基因扩增引物：上游引物CICC-Oph-F1：5’-GCCAATCCCATCAACAT-3’下游引物CICC-Oph-R1：5’-CACCACCAACGACAAAA-3’冬虫夏草寄主蝠蛾特征性持家基因扩增引物：上游引物CICC-Hep-F1：5’-GGGGCATCAGTAGATTTAGC-3’下游引物CICC-Hep-R1：5’-CAAATAATGGTATGCGGTCA-3’。3.按照权利要求2所述的冬虫夏草原草粉鉴真方法，其特征在于：PCR扩增反应体系为25μL，其中10×Taqreactionbuffer2.5μL，4条引物(10μmol/L)各1μL，10μmol/L的dNTP2μL，2.5U的Taq酶0.5μL，DNA模板1.0μL，ddH2O15μL。4.按照权利要求3所述的冬虫夏草原草粉鉴真方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min，进入循环：95℃10s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，然后72℃延伸5min。2CN103233062A说明书1/3页一种冬虫夏草原草粉的双重PCR鉴真方法技术领域[0001]本发明属于药材鉴真领域，具体涉及冬虫夏草原草粉的鉴真方法。背景技术[0002]冬虫夏草在传统上多为煎汤或炖服，由于未打破虫草的细胞壁，有效成分难以溶出，不利于人体吸收。为提高冬虫夏草的利用效率，增加人体对冬虫夏草有效成分的吸收，有效的方法是将冬虫夏草粉碎后，制成片剂、胶囊剂、丸剂、酒剂等剂型产品后服用。以往通过形态识别，优质的原草容易为消费者接受，但经过粉碎加工以后，消费者的接受程度就大大降低。冬虫夏草原草深加工产品品质控制已成为制约冬虫夏草产业发展和升级的关键问题。[0003]目前，针对冬虫夏草与其形态相似伪品的鉴别研究已有多个专利报道，2000年11月12日公开的中国专利CN1274010A和2001年6月6日公开的中国专利CN1298024A分别针对冬虫夏草菌种的rDNA间区和18SrDNA进行引物和探针设计，实现在分子水平上对冬虫夏草菌种的道地性鉴别。2011年6月8日公开的中国专利CN102086471A针对冬虫夏草菌种的rDNA间区进行研究，并建立了一种既能鉴别冬虫夏草真伪、又能明确其含量的分子鉴别技术；2011年10月26日公开的中国专利CN102226217A则针对冬虫夏草菌种的18SrDNA进行引物设计，并开发出试剂盒应用于冬虫夏草的真伪鉴别。以上鉴别方法主要应用于冬虫夏草及其形态相似伪品的区分，而对冬虫夏草原草粉的鉴真无显著效果，难以在保证冬虫夏草原草粉的品质上发挥作用。[0004]因此，在本领域需要有一种新的检测方法用于冬虫夏草原草粉的鉴真，实现对其品质的控制和管理。发明内容[0005]本发明的目的是提供一种可用于冬虫夏草原草粉鉴真的可靠方法。[0006]为达到上述目的，本发明根据冬虫夏草的组成特点，设计冬虫夏草菌种和寄主蝠蛾特征性持家基因的PCR引物，进行一次单管双重PCR反应，同时扩增冬虫夏草菌种和寄主蝠蛾特征性持家基因，实际扩增片断分别为320bp