富集氯霉素和/或氯霉素碱的免疫亲和吸附剂及其制备方法与应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103480349103480349A(43)申请公布日2014.01.01(21)申请号201310411299.5(22)申请日2013.09.11(71)申请人广西壮族自治区粮油科学研究所地址530002广西壮族自治区南宁市南梧路316号(72)发明人刘运龙谢军李炜李川山周晓韦素梅谢体三萧浩潘艳坤徐德林林丰(74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人关畅任凤华(51)Int.Cl.B01J20/281(2006.01)B01J20/30(2006.01)G01N1/40(2006.01)权权利要求书2页利要求书2页说明书9页说明书9页附图1页附图1页(54)发明名称富集氯霉素和/或氯霉素碱的免疫亲和吸附剂及其制备方法与应用(57)摘要本发明公开了富集氯霉素和/或氯霉素碱的免疫亲和吸附剂及其制备方法与应用。该富集氯霉素和/或氯霉素碱的免疫亲和吸附剂，是将氯霉素多克隆抗体和过碘酸氧化的固相载体偶联得到的偶联物；所述氯霉素多克隆抗体按照包括如下步骤的方法制备：以碘乙酰氯霉素碱与载体蛋白的偶联物为免疫原免疫非人哺乳动物得到抗血清，从所述抗血清中纯化得到氯霉素多克隆抗体。本发明富集氯霉素的免疫亲和吸附剂及其亲和色谱柱具有浓缩待测样品中氯霉素浓度，提高检测下限、排除杂质干扰、提高检测准确性和可靠性、减少样品过柱时间达到快速检测的作用。CN103480349ACN103489ACN103480349A权利要求书1/2页1.制备富集氯霉素和/或氯霉素碱的免疫亲和吸附剂的方法，包括将氯霉素多克隆抗体和过碘酸氧化的固相载体偶联得到富集氯霉素和/或氯霉素碱的免疫亲和吸附剂的步骤；所述氯霉素多克隆抗体按照包括如下步骤的方法制备：以碘乙酰氯霉素碱与载体蛋白的偶联物为免疫原免疫非人哺乳动物得到抗血清，从所述抗血清中纯化得到氯霉素多克隆抗体。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述碘乙酰氯霉素碱按照包括如下步骤的方法制备；1）将碘乙酸通过N,N-二环己基碳化二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺形成活性酯，所述活性酯为NHS-碘乙酰活性酯；2）将所述NHS-碘乙酰活性酯与氯霉素碱进行酰化反应，得到碘乙酰氯霉素碱。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述1）为将碘乙酸、N-羟基琥珀酰亚胺和N,N-二环己基碳化二亚胺在黑暗中进行缩合反应，得到NHS-碘乙酰活性酯。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述1）为将碘乙酸、N-羟基琥珀酰亚胺和N,N-二环己基碳化二亚胺以269:695:582的摩尔比，在四氢呋喃中，20℃-25℃在黑暗中进行缩合反应，反应完毕后，以10000g离心，取上清液得到NHS-碘乙酰活性酯；所述2）为a）和b）：a）将氯霉素碱和三乙胺的四氢呋喃溶液和所述上清液在20-25℃进行酰化反应，得到碘乙酰氯霉素碱混合物；所述氯霉素碱和三乙胺的四氢呋喃溶液的溶质是氯霉素碱和三乙胺，溶剂是四氢呋喃；b）将所述碘乙酰氯霉素碱混合物进行HPLC纯化收集保留时间为8.6分钟的层析峰，得到碘乙酰氯霉素碱；所述HPLC纯化中，色谱柱：UltimateXB-C18反相柱，250mm×4.6mm，粒径5μm；流动相：第0-5min用乙腈和水按照11：9的体积比混合得到的混合液作为流动相，第5-10min用乙腈和所述水按照13：7的体积比混合得到的混合液作为流动相，第10-12min用乙腈和所述水按照11：9的体积比混合得到的混合液作为流动相，所述水用冰醋酸调至pH为3；检测波长：254nm；流速：1.0mL/min；柱温35℃。5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：从所述抗血清中纯化得到氯霉素多克隆抗体的方法包括：用所述碘乙酰氯霉素碱与巯基化固相载体偶联得到的偶联物作为纯化所述氯霉素多克隆抗体的亲和层析介质，从所述抗血清中通过亲和层析纯化得到所述氯霉素多克隆抗体；和/或所述亲和层析中用体积百分浓度为3%的乙酸水溶液洗脱所述氯霉素多克隆抗体。6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述过碘酸氧化的固相载体为过碘酸氧化的琼脂糖凝胶或过碘酸氧化的葡聚糖凝胶；和/或，所述巯基化固相载体为巯基化的琼脂糖凝胶或巯基化的葡聚糖凝胶；和/或，所述载体蛋白为血兰蛋白或牛血清白蛋白。7.由权利要求1-6中任一所述的方法制备的富集氯霉素和/或氯霉素碱的免疫亲和吸附剂。8.以权利要求7所述的免疫亲和吸附剂为填料的富集氯霉素和/或氯霉素碱的免疫亲和色谱柱。2CN103480349A权利要求书2/2页9.含有权利要求7所述的免疫亲和吸附剂或权利要求8所述的免疫亲和色谱柱的富集氯霉素和/或氯霉素碱的试剂。10.权利要求7所述的免疫