快速检测猪萨佩罗病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103614493103614493A(43)申请公布日2014.03.05(21)申请号201310560789.1(22)申请日2013.11.12(71)申请人西南民族大学地址610041四川省成都市武侯区、一环路南四段16号(72)发明人兰道亮陈亚冰李键吉文汇孙焕华修国(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/68(2006.01)C12Q1/06(2006.01)权利要求书1页权利要求书1页说明书4页说明书4页序列表1页序列表1页附图1页附图1页(54)发明名称快速检测猪萨佩罗病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用(57)摘要本发明公开了首个快速检测猪萨佩罗病毒感染的荧光定量PCR试剂盒及应用，该试剂盒含有a)RNA裂解液，b)PrimeScript®RTEnzymeMixI，c)逆转录反应液，d)定量引物F及R，e)SYBR®PremixExTaqII，f)标准阳性模板，g)阴性对照品等。采用本发明的试剂盒进行检测，简化了操作步骤，缩短了反应时间，减少了污染几率，并且能够提高检测的准确度和速度，一个样本可在3个小时内完成检测。荧光定量PCR在扩增完成后可以直接通过标准曲线定量起始病毒的拷贝数，能为流行病学提供可靠信息，该试剂盒还可以应用于（抗）猪萨佩罗病毒药物的研究，对生物制品进行定量检测及质量监控；应用前景十分广泛。CN103614493ACN103649ACN103614493A权利要求书1/1页1.快速定量检测猪萨佩罗病毒的荧光定量PCR试剂盒，试剂盒包括：a)RNA裂解液，b)PrimeScript®RTEnzymeMixI，c)逆转录反应液，d)定量引物F及R,e)SYBR®PremixExTaqII，f)ROXReferenceDye，g)标准阳性模板，h)阴性对照品，i)无菌双蒸水所述逆转录反应液含有5×PrimeScript®Buffer，OligodTPrimer，Random6mers引物，标准阳性模板是含有猪嵴病毒特异性目的片段的质粒，阴性对照样品由SPF猪粪便样品中提取RNA，经过逆转录获得的cDNA样品，SYBR®PremixExTaqII液含有TaKaRaExTaqHS，dNTPMixture，Mg2+，TliRNaseH，SYBR®GreenI。2.根据权利要求1所述的萨佩罗病毒荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述引物为F：5’-CAGACAAATCAACAACTTTCCAA-3’R：5’-ATCTAACCAAGACCTACGCAGC-3’。3.根据权利要求1所述的定量检测试剂盒，其特征在于灵敏度达到70copies/μL，完全可以满足萨佩罗病毒的快速检测及定量的要求。2CN103614493A说明书1/4页快速检测猪萨佩罗病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及首次发明一种快速检测猪萨佩罗病毒的SYBRGree实时荧光定量PCR试剂盒。该试剂盒可高效方便地对临床样本中猪萨佩罗病毒进行检测及定量，可以进行猪萨佩罗病毒的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。背景技术[0002]猪萨佩罗病毒(Porcinesapelovirus,PSV)是一类无囊膜，微球型，单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科，由于最初从腹泻猪的肠道中分离得到，所以先前称为猪肠道病毒8型(Porcineenterovirus8,PEV-8)，归为猪肠道病毒II类群(PorcineenterovirusA，PEVA)。近年来，由于病毒基因组学及分子遗传进化分析的发展，该病毒已与亲缘关系较近的一类猿猴及禽小RNA病毒单独划分为萨佩罗病毒属，其也改称为猪萨佩罗病毒。[0003]PSV主要通过口腔进入体内，也有通过呼吸道等途径传播的，在粪便、呼吸道的分泌物及其污染物，都可携带病毒，导致其它易感猪的感染。PSV进入机体后，常引起腹泻，有时可引起病毒血症，可导致中枢神经受损，引起脑脊髓炎。怀孕母猪感染后，由于病毒血症经血源性传播，导致子宫感染引起胚胎和胎儿感染，造成胚胎死亡、死产、木乃伊胎和胎儿畸形等。[0004]近年来，随着规模化养猪业的发展及畜产品流通渠道的增多，我国猪群中肠道、呼吸道、生殖器官疾病以及脑脊髓炎等多系统综合征频繁发生，长期以来猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪捷申病毒(PTV)被认为是引起该类疾病的主要病原体，但PSV这个经典肠道病毒却一直没有引起相应的重视。[0005]鉴于此，研发一种快速检测猪萨佩罗病毒感染的荧光定量PCR试剂盒，可高效方便地对临床样本中猪萨佩