一种海豚链球菌环介导等温扩增试剂盒及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN104651518A(43)申请公布日2015.05.27(21)申请号201510095340.1(22)申请日2015.03.04(71)申请人广西壮族自治区兽医研究所地址530000广西壮族自治区南宁市友爱北路51号(72)发明人李军罗洪林冯世文彭昊陈福艳黄婷杨威陈泽祥张瑶瑶潘艳(74)专利代理机构广州市红荔专利代理有限公司44214代理人李珊(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12Q1/14(2006.01)C12R1/46(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图3页(54)发明名称一种海豚链球菌环介导等温扩增试剂盒及其应用(57)摘要本发明公开了一种海豚链球菌环介导等温扩增试剂盒及其应用，该试剂盒包括LAMP引物、2×反应缓冲液、BstDNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和海豚链球菌DNA模板，所述的LAMP引物包括外引物F3与B3和内引物FIP与BIP。其应用的特异性检测和敏感性检测证实，本发明提供的LAMP检测方法可实时监测反应并且定量检测出海豚链球菌的拷贝数，快速准确的获得检测结果，为简便、快速地检测海豚链球菌带来便利。CN104651518ACN104651518A权利要求书1/1页1.一种海豚链球菌环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括LAMP引物、2×反应缓冲液、BstDNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和海豚链球菌DNA模板，所述的LAMP引物包括外引物F3（SEQIDNO：1）与B3（SEQIDNO：2）和内引物FIP（SEQIDNO：3）与BIP（SEQIDNO：4）；其中引物的序列分别为：F3AAGCAGATTTGGAACAAGCB3TTTAAGAGCAGGTTTTTCTTCTFIPTCTGCCAATTGTTTTTGAAGTTCAGTGCACGAGAATTAGATACGCBIPAACACAGAATTAACAGCAACTGTTGGCTTCTTTCTTAGCCGCT；所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine和dNTPs。2.根据权利要求1所述的海豚链球菌环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的海豚链球菌DNA模板提取自海豚链球菌培养物，使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取。3.根据权利要求1所述的海豚链球菌环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。4.根据权利要求1所述的海豚链球菌环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL30-60mM、KCL25-40mM、MgSO415-25mM、(NH4)2SO425-30mM、Tween200.3-0.7℅、Betaine1.5-3.5M和dNTPs3-5mM。5.一种海豚链球菌环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，用于检测疑似海豚链球菌，具体检测步骤包括：（1）LAMP引物的设计与合成（2）海豚链球菌DNA模板的提取（3）LAMP反应体系建立（4）LAMP检测方法。6.根据权利要求5所述的海豚链球菌环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述LAMP反应体系建立以25μL计，2×反应缓冲液12.5μLBstDNA聚合酶1μLFIP40pmolBIP40pmolF35pmolB35pmol海豚链球菌DNA2μL超纯水补足25μL。7.根据权利要求5所述的海豚链球菌环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，其特征在于，所述的LAMP检测方法检测样品溶液为提取的海豚链球菌、对照细菌以及临床分离菌的基因组DNA。8.根据权利要求5所述的海豚链球菌环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的LAMP检测方法采用实时浊度仪进行密闭全程监控。2CN104651518A说明书1/6页一种海豚链球菌环介导等温扩增试剂盒及其应用[0001]技术领域[0002]本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定量检测海豚链球菌的环介导等温扩增试剂盒及其应用。背景技术[0003]鱼类链球菌病是一种由链球菌感染引起的疾病，病原菌归属3个属和7个种。链球菌属的病原菌有海豚链球菌(Streptococcusiniae)、无乳链球菌(Streptococcusagalactme)、副乳房炎链球菌(Streptococcusparauberis)及停乳链球菌(Streptococcusdysgalactiae)；乳球菌属的有格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)和鱼乳球菌(Lactococcuspiscium)；漫游菌属的有鲑鱼漫游菌(Vagococcussalmoninarum)。