一种牛支原体环介导等温扩增试剂盒及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN104651519A(43)申请公布日2015.05.27(21)申请号201510095946.5C12R1/35(2006.01)(22)申请日2015.03.04(71)申请人广西壮族自治区兽医研究所地址530000广西壮族自治区南宁市友爱北路51号(72)发明人潘艳李军冯世文彭昊陈泽祥陶立胡帅杨威钟舒红谢宇舟禤雄标马春霞柳锋谢永平许力干韦志锋秦若甫兰美益(74)专利代理机构广州市红荔专利代理有限公司44214代理人李珊(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12Q1/04(2006.01)权利要求书1页说明书5页附图2页(54)发明名称一种牛支原体环介导等温扩增试剂盒及其应用(57)摘要本发明公开一种牛支原体环介导等温扩增试剂盒及其应用，该试剂盒包括LAMP引物、2×反应缓冲液、BstDNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和牛支原体DNA模板，所述的LAMP引物包括外引物F3与B3和内引物FIP与BIP。特异性检测和敏感性检测证实，本发明提供的LAMP检测方法可实时监测反应并且定量检测出牛支原体的拷贝数，快速准确的获得检测结果，为简便、快速和可靠的检测牛支原体带来便利。CN104651519ACN104651519A权利要求书1/1页1.一种牛支原体环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括LAMP引物、2×反应缓冲液、BstDNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和牛支原体DNA模板，所述的LAMP引物包括外引物F3（SEQIDNO：1）与B3（SEQIDNO：2）和内引物FIP（SEQIDNO：3）与BIP（SEQIDNO：4）；其中引物的序列分别为：F3AGGAGGAGAAAAAAGCCTATB3GCTAAAACTGAAGCTTGCAFIPCGCCACTTAATGTATGTGGATATCTGGCCTTTTGGAAAGATTTGGBIPACAATGGTTGTTGCTTTAAAACCACAGTTGGATCTAAAGCAGTAG；所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine和dNTPs。2.根据权利要求1所述的牛支原体环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的牛支原体DNA模板，是使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取的牛支原体培养物或疑似感染牛支原体的临床病变肺组织的基因组DNA。3.根据权利要求1所述的牛支原体环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。4.根据权利要求1所述的牛支原体环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL25-60mM、KCL15-40mM、MgSO410-20mM、(NH4)2SO415-25mM、Tween200.3-0.8℅、Betaine1.5-4M和dNTPs2.5-5mM。5.一种牛支原体环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，用于检测疑似牛支原体或检测疑似感染牛支原体的临床病变肺组织是否存在牛支原体，具体检测步骤包括：（1）LAMP引物的设计与合成（2）牛支原体DNA模板的提取（3）LAMP反应体系建立（4）LAMP检测方法。6.根据权利要求5所述的牛支原体环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的LAMP反应体系建立以25μL计，2×反应缓冲液12.5μLBstDNA聚合酶1μLFIP40pmolBIP40pmolF35pmolB35pmol牛支原体DNA2μL超纯水补足25μL。7.根据权利要求5所述的牛支原体环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的方法。8.根据权利要求5所述的牛支原体环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的LAMP检测方法采用实时浊度仪进行密闭全程监控。2CN104651519A说明书1/5页一种牛支原体环介导等温扩增试剂盒及其应用技术领域[0001]本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定量检测牛支原体的环介导等温扩增试剂盒及其应用。背景技术[0002]牛支原体(Mycoplasmabovis)是感染牛的一种重要的致病性病原体，1961年Hale在美国首次从患乳腺炎的牛乳中分离到该病原，1976年首次报道与牛呼吸系统疾病有关。目前已证实牛支原体除导致牛肺炎、乳腺炎外，还可导致关节炎、角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎症、流产与不孕等多种疾病。[0003]该病在世界范围内存在，欧洲每年约有25%~33%的犊牛肺炎是由牛支原体引起的，相当于每年损失1.44亿~1.92亿欧元，其中英国每年有190万头牛患牛支原体肺炎，