同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的GeXP快速检测引物组、试剂盒及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105316430A(43)申请公布日2016.02.10(21)申请号201510843525.6(22)申请日2015.11.27(71)申请人广西壮族自治区兽医研究所地址530001广西壮族自治区南宁市友爱北路51号(72)发明人谢芝勋李孟谢志勤罗思思谢丽基黄莉邓显文黄娇玲范晴张艳芳曾婷婷王盛(74)专利代理机构北京中誉威圣知识产权代理有限公司11279代理人王正茂(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/93(2006.01)权利要求书1页说明书12页附图2页(54)发明名称同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的GeXP快速检测引物组、试剂盒及其应用(57)摘要本发明属于禽类病毒检测技术领域，本发明公开了一种同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的GeXP引物组、试剂盒及其应用。发明人基于GeXP系统研究设计了5对特异性引物和1对通用引物，据此建立了同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的GeXP快速检测试剂盒。应用本发明可同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感病毒，灵敏度为102拷贝/μL。本发明具有高通量、特异性强、灵敏度高且快速等优点，对H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的流行病学调查及其鉴别诊断具有重要意义。CN105316430ACN105316430A权利要求书1/1页1.一种同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的GeXP引物组，其特征在于：包括5对特异性引物，分别是引物对M-1和M-2、引物对AIV-H5-1和AIV-H5-2、引物对AIV-H9-1和AIV-H9-2、引物对AIV-N2-1和AIV-N2-2、引物对AIV-N1-1和AIV-N1-2，其分别具有如SEQIDNo.1至SEQIDNo.10所示的序列。2.根据权利要求1所述的同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的GeXP引物组，其特征在于：还包括1对通用引物，上游通用引物为Cy5-Tag-F，下游通用引物为Tag-R，分别具有如SEQIDNo.11至SEQIDNo.12所示的序列。3.一种同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的GeXP试剂盒，包括反转录RT反应液、PCR反应液、DEPC水和超纯水；所述的反转录RT反应液含有5×ReverseTranscriptaseBuffer、50pmolRandomPrimer(12mer)、10mMdNTPMixture、40URibonucleaseInhibitor和5U/μLAMVReverseTranscriptase；所述的PCR反应液含有10×PCRbuffer、25mMMgCl2、10mMdNTPMixture，5对特异性引物混合物，10μM/L上、下游通用引物混合物，JumpStartTaqDNAPolymerase；其特征在于：所述的5对特异性引物分别是引物对M-1和M-2、引物对AIV-H5-1和AIV-H5-2、引物对AIV-H9-1和AIV-H9-2、引物对AIV-N2-1和AIV-N2-2、引物对AIV-N1-1和AIV-N1-2；1对通用引物分别为Cy5-Tag-F和Tag-R，其分别具有如SEQIDNo.1至SEQIDNo.12所示的序列。4.根据权利要求3所述的同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的GeXP试剂盒，其特征在于：所述的5对特异性引物中引物对M-1和M-2、引物对AIV-H5-1和AIV-H5-2、引物对AIV-H9-1和AIV-H9-2、引物对AIV-N2-1和AIV-N2-2、引物对AIV-N1-1和AIV-N1-2在PCR反应体系中对应的的摩尔浓度分别为100nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、100nmol/L、50nmol/L；所述的1对通用引物Cy5-Tag-F和Tag-R在PCR反应体系中的摩尔浓度为500nmol/L。5.根据权利要求3所述的同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的GeXP试剂盒，其特征在于：所述的反转录RT反应液每管9μL，含有5×ReverseTranscriptaseBuffer5μL、50pmolRandomPrimer(12mer)1μL、10mMdNTPMixture2μL、40URibonucleaseInhibitor0.5μL和5U/μLAMVReverseTranscriptase0.5μL；所述的PCR反应液每管9.7μL，含有10×PCRbuffer2.5μL，25mMMgCl22.5μL，10mMdNTPMixture1μL，5对特异性引物混合物1.25μL，10μM/L上、下游通用引物混合物1