丝素固定芋头多酚氧化酶的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109337892A(43)申请公布日2019.02.15(21)申请号201811427743.1(22)申请日2018.11.27(71)申请人贺州学院地址542899广西壮族自治区贺州市西环路18号(72)发明人谢微段振华朱东建蔡文康超(74)专利代理机构深圳益诺唯创知识产权代理有限公司44447代理人肖婉萍(51)Int.Cl.C12N11/02(2006.01)C12N9/02(2006.01)C07K14/435(2006.01)C07K1/14(2006.01)权利要求书2页说明书8页附图3页(54)发明名称丝素固定芋头多酚氧化酶的方法(57)摘要本发明公开了一种丝素固定芋头多酚氧化酶的方法，该方法包括如下步骤：以丝素为载体对芋头多酚氧化酶进行固定化，考察固定化温度、固定化时间、pH值及PPO粗酶液与固定化酶的固液比为吸附条件，依据考马斯亮蓝法，通过紫外-可见分光光度法检测，利用标准曲线和计算公式，确定固定化过程中多酚氧化酶的负载量、固定化酶活力、活力回收率及酶吸附含量。本发明成本较低，操作简单，原料广泛易得，而且制得的固定化酶具有酶的稳定性，并保持芋头多酚氧化酶的高效、专一性，并且具有分离回收便捷、重复使用，连续操作可控性好等特点。CN109337892ACN109337892A权利要求书1/2页1.一种丝素固定芋头多酚氧化酶的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：a、芋头多酚氧化酶粗酶液的制备：将芋头切块，加入磷酸盐缓冲液，按芋头与磷酸盐缓冲液固液比为1:2进行均质，将均质的混合液进行离心，经静置后，上清液即为芋头多酚氧化酶粗酶液；b、丝素的制备：将蚕茧剪成1～2cm2的小片，将蚕茧小片置于0.5％碳酸钠(w/v＝1:50)溶液中，在沸水中加热脱胶两次，每次0.5h，烘干即得丝素；c、丝素固定芋头多酚氧化酶：向芋头多酚氧化酶粗酶液中加入丝素进行芋头多酚氧化酶固定化，并根据考马斯亮蓝法，通过紫外-可见分光光度法检测，利用标准曲线和计算公式，确定固定化过程中多酚氧化酶的负载量、固定化酶活力、活力回收率及酶吸附含量。2.如权利要求1所述的丝素固定芋头多酚氧化酶的方法，其特征在于，步骤c中，所述固定化时间为20min。3.如权利要求1所述的丝素固定芋头多酚氧化酶的方法，其特征在于，步骤c中，所述丝素与芋头多酚氧化酶粗酶液的固液比为1:25。4.如权利要求1所述的丝素固定芋头多酚氧化酶的方法，其特征在于，步骤c中，所述反应体系溶液的pH值为7。5.如权利要求1所述的丝素固定芋头多酚氧化酶的方法，其特征在于，步骤c中，所述固定化温度为40℃。6.如权利要求1所述的丝素固定芋头多酚氧化酶的方法，其特征在于，步骤c中，所述紫外-可见分光光度法的吸收波长为595nm。7.如权利要求1所述的丝素固定芋头多酚氧化酶的方法，其特征在于，步骤c中，所述固定化过程中多酚氧化酶的负载量＝原酶液蛋白质浓度-固定化酶滤出蛋白质浓度。8.如权利要求1所述的丝素固定芋头多酚氧化酶的方法，其特征在于，步骤c中，所述固定化酶活力的计算公式：式中：△A——某一段时间内吸光度的改变N——总酶液体积与参与反应的提取体积之比T——反应时间(min)W——样品重量(g)活力回收率的计算公式：式中：r——固定化酶的活力(U/g)R——相同条件下游离酶的活力(U/g)酶吸附含量的计算公式：式中：M——酶吸附含量mg/gC1——上清液未吸附的浓度(mg/mL)2CN109337892A权利要求书2/2页C2——上清液吸附后的浓度(mg/mL)m——加入的材料的质量(g)。9.如权利要求1所述的丝素固定芋头多酚氧化酶的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：a、芋头多酚氧化酶粗酶液的制备：将芋头切块，加入磷酸盐缓冲液，按芋头与磷酸盐缓冲液固液比为1：2进行均质，将均质后的混合液进行离心，经静置后，上清液即为芋头多酚氧化酶粗酶液；b、丝素的制备：将蚕茧剪成1～2cm2的小片，将蚕茧小片置于0.5％碳酸钠(w/v＝1:50)溶液中，在沸水中加热脱胶两次，每次0.5h，烘干即得丝素；c、丝素固定芋头多酚氧化酶：在反应温度为40℃，溶液的pH值为7下，向芋头多酚氧化酶粗酶液中加入丝素进行芋头多酚氧化酶固定化20min，所述丝素与芋头多酚氧化酶粗酶液的固液比为1:25，并根据考马斯亮蓝法，通过紫外-可见分光光度法检测，利用标准曲线和计算公式，确定固定化过程中多酚氧化酶的负载量、固定化酶活力、活力回收率及酶吸附含量。3CN109337892A说明书1/8页丝素固定芋头多酚氧化酶的方法【技术领域】[0001]本发明属于材料领域，具体涉及一种成本低、操作简单，且制得的固化酶具有酶的稳定性、高效性、专一性的丝素