酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109627244A(43)申请公布日2019.04.16(21)申请号201811527050.X(22)申请日2018.12.13(71)申请人浙江圣达生物药业股份有限公司地址317299浙江省台州市天台县赤城街道人民东路789号(72)发明人庞正查张仲景陈天松梁超刘露王程鹏(74)专利代理机构台州蓝天知识产权代理有限公司33229代理人孙炜(51)Int.Cl.C07D475/04(2006.01)C12P17/18(2006.01)权利要求书1页说明书6页(54)发明名称酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙(57)摘要本发明属于酶法合成的技术领域，涉及一种酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙的方法，所述方法包括如下步骤：(1)以叶酸为原料，使用锌粉将叶酸还原为二氢叶酸；(2)二氢叶酸中加入二氢叶酸还原酶、葡萄糖脱氢酶，反应得到L-四氢叶酸；(3)L-四氢叶酸中加入甲醛和硼氢化物反应得到L-5-甲基四氢叶酸；(4)L-5-甲基四氢叶酸成盐得到L-5-甲基四氢叶酸钙。本发明提供了一条行之有效的使用酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙的方法，这种制备方法不用拆分，反应温和，收率高，产品纯度高，环境友好，具有很好的产业化前景。CN109627244ACN109627244A权利要求书1/1页1.酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙，包括如下步骤：(1)以叶酸为原料，使用锌粉将叶酸还原为二氢叶酸；(2)二氢叶酸中加入二氢叶酸还原酶、葡萄糖脱氢酶，反应得到L-四氢叶酸；(3)L-四氢叶酸中加入甲醛和硼氢化物反应得到L-5-甲基四氢叶酸；(4)L-5-甲基四氢叶酸成盐得到L-5-甲基四氢叶酸钙。2.根据权利要求1所述的酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙，其特征在于，所述步骤(1)中锌粉还原叶酸的反应是在碱性环境下进行的，所述锌粉与叶酸的质量比为1：2-1：4，反应时间为1-3小时，反应温度为10-50℃。3.根据权利要求1所述的酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙，其特征在于，所述二氢叶酸还原酶为二氢叶酸还原酶湿菌体、葡萄糖脱氢酶为葡萄糖脱氢酶发酵湿菌体。4.根据权利要求3所述的酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙，其特征在于，所述步骤(2)的反应中加入葡萄糖、NADP和EDTA。5.根据权利要求3所述的酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙，其特征在于，所述二氢叶酸还原酶湿菌体、葡萄糖脱氢酶发酵湿菌体与叶酸的质量比为2：1：10-3：2：10，优选为2：1：10。6.根据权利要求4所述的酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙，其特征在于，所述葡萄糖、NADP和EDTA的加入量分别为叶酸质量的45％-50％、0.2％-0.5％、10％-20％。7.根据权利要求1所述的酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙，其特征在于，步骤(2)的反应时间为1-3小时，反应温度为10-50℃，优选为35℃反应3小时。8.根据权利要求1所述的酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙，其特征在于，步骤(2)反应结束后使用盐酸调节pH值至3.3-3.5。9.根据权利要求1所述的酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙，其特征在于，步骤(3)在碱性环境下滴加甲醛，之后在0-10℃下滴加硼氢化物，升温至35-75℃保温反应，反应时间为0.5-2小时。10.根据权利要求1所述的酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙，其特征在于，所述甲醛的加入量为叶酸的当量比为1：1-1.3：1，所述硼氢化物为硼氢化钾或硼氢化钠，其加入量与叶酸的当量比为3：1-4：1。2CN109627244A说明书1/6页酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙技术领域[0001]本发明属于酶法合成的技术领域，涉及一种酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙的方法。背景技术[0002]L-5-甲基四氢叶酸钙，又称(6S)-5-甲基四氢叶酸钙。(6S)-5-甲基四氢叶酸是组织和血叶酸的主要形式，它在人体中不需要经过繁琐的酶促步骤，可以直接参与人体内多种重要的生化反应(如嘌呤和胸腺嘧啶的合成等)。L-5-甲基四氢叶酸可用做药和食品添加剂，用作维生素制剂，预防神经管缺陷，治疗抑郁症，治疗巨幼红细胞贫血等，研究表明，L-5-甲基四氢叶酸是叶酸类药物中唯一可以渗透过血脑屏障的药物，具有防治阿尔茨海默病(老年痴呆症)的作用，因此它具有其他叶酸类药物无法比拟的优越性，具有巨大的市场前景。由于L-5-甲基四氢叶酸非常不稳定，极易氧化，因此合成高纯度、高稳定性的四氢叶酸具有成本昂贵、收率低等缺点，而四氢叶酸盐具有优异的稳定性，大量实验证明，在特定的碱溶液中可以分离纯化出高纯度、高稳定性的四氢叶酸盐，特别是其钙盐L-5-甲基四氢叶酸钙。[0003]现有技术中的L-5-甲基四氢叶酸钙合成方法，均是使用化学合成，化学合成的5-甲基四氢叶酸主要是通过叶