含有胶原酶的组合物及其制备方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109735515A(43)申请公布日2019.05.10(21)申请号201811594139.8C07K14/81(2006.01)(22)申请日2018.12.25C12N5/071(2010.01)C12N5/09(2010.01)(71)申请人中国医学科学院北京协和医院地址100730北京市东城区王府井帅府园1号(72)发明人吴文铭彭俊雅陈澔黄丹刘路路洪夏飞丛林李冬晶赵玉沛(74)专利代理机构北京润平知识产权代理有限公司11283代理人刘依云王崇(51)Int.Cl.C12N9/16(2006.01)C12N9/50(2006.01)C12N9/64(2006.01)权利要求书1页说明书8页附图3页(54)发明名称含有胶原酶的组合物及其制备方法和应用(57)摘要本发明涉及酶工程领域，公开了含有胶原酶的组合物及其制备方法和应用。所述组合物含有VIII型胶原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶，其中，所述VIII型胶原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶的酶活力单位之间的比值为100-312.5:1-5:5000-25000:1。本发明公开的制备含有胶原酶的组合物的方法包括：混合VIII型胶原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶。本发明还公开了如上所述的组合物在从胰腺样品中分离单细胞中的应用。本发明能够实现单细胞的高收率和高活率提取，特别是胰腺组织，攻克了现有胰腺组织单细胞收率和活率较低的难题。CN109735515ACN109735515A权利要求书1/1页1.一种含有胶原酶的组合物，其特征在于，该组合物含有VIII型胶原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶，其中，所述VIII型胶原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶的酶活力单位之间的比值为100-312.5:1-5:5000-25000:1。2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述中性蛋白酶为DispaseII；和/或，所述脱氧核糖核酸酶为DNaseI。3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述组合物还含有溶剂，相对于每毫克的VIII型胶原酶，所述溶剂的含量为0.1-12.5mL。4.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述溶剂为含有4-10体积％胎牛血清的磷酸盐缓冲液。5.一种制备含有胶原酶的组合物的方法，其特征在于，该方法包括：混合VIII型胶原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶，其中，所述VIII型胶原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶的酶活力单位之间的比值为100-312.5:1-5:5000-25000:1。6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述中性蛋白酶为DispaseII；和/或，所述脱氧核糖核酸酶为DNaseI。7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，混合的方式为：先将VIII型胶原酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂预混，用溶剂溶解预混物，再往混合体系中引入脱氧核糖核酸酶；相对于每毫克的VIII型胶原酶，所述溶剂的用量为0.1-12.5mL。8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述溶剂为含有4-10体积％胎牛血清的磷酸盐缓冲液。9.权利要求1-4中任意一项所述的组合物在从胰腺样品中分离单细胞中的应用，特别是在制备用于从胰腺样品中分离单细胞的试剂盒中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其中，所述胰腺样品为正常胰腺组织和/或胰腺肿瘤组织。2CN109735515A说明书1/8页含有胶原酶的组合物及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明涉及酶工程领域，具体涉及含有胶原酶的组合物及其制备方法和应用。背景技术[0002]胰腺是人体中兼具内分泌和外分泌功能的器官。组织学上包含胰岛细胞、腺泡细胞、导管细胞以及间质细胞等多个细胞组分。胰腺产生分泌的胰液中含有胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶等多种消化酶。随着近年来单细胞分析技术的兴起，人们对与人体组织器官的研究从不同成分混合，互相干扰的整体组织分析逐渐深入到对构成组织器官的单个细胞的研究，其重要性不言而喻。而在胰腺研究领域，由于胰腺器官大体上柔软而脆弱、组织学上成分复杂且因为强效的胰酶而容易发生自身消化，使得胰腺单细胞研究往往止步于第一步——也即可供分析的胰腺组织单细胞的获取。[0003]人体或动物模型组织器官单细胞分离方法，从最初的毛细管吸取，到流式分选再到微流体技术，众多的单细胞分离技术在不同的组织当中或多或少都取得了较为满意的结果，但在胰腺组织上则差强人意。通过查阅文献可知，目前研究人员在分离小鼠胰腺癌单细胞时，大多采用以II型胶原酶为主的酶消化解离方法，但是，胰腺单细胞研究者均表示在胰腺单细胞分离时遇到了极大的挑战，要么单细胞收率不高，要么细胞活率较低，