一种静息细胞转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110656148A(43)申请公布日2020.01.07(21)申请号201910982613.2(22)申请日2019.10.16(71)申请人湖南新合新生物医药有限公司地址415400湖南省常德市津市市嘉山工业新区(72)发明人杨芳刘喜荣孟浩曾春玲赵小娟(74)专利代理机构长沙和雅知识产权代理事务所(普通合伙)43238代理人林传贵(51)Int.Cl.C12P33/02(2006.01)C12N1/20(2006.01)C12R1/32(2006.01)权利要求书2页说明书6页(54)发明名称一种静息细胞转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法(57)摘要本发明涉及甾体类药物中间体的生产方法，具体来说是一种静息细胞转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法。发明内容包括3位羟基保护反应、静息细胞生物转化、水解、精制步骤。本发明以植物甾醇为原料生产去氢表雄酮，原料易得，降低了生产成本，收率更高，反应路线更短，省掉了许多传统制备方法所需要的反应步骤和后处理步骤；采用静息细胞转化法，转化体系营养单一，染菌风险低，菌体量可调节，可保证良好的转化能力。CN110656148ACN110656148A权利要求书1/2页1.一种静息细胞转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)3位羟基保护反应：利用甲缩醛作为保护剂，将植物甾醇的3位羟基进行保护，得到植物甾醇醚化物，反应过程中加入五氧化二磷作为催化剂和硅藻土作为助滤剂；(2)静息细胞生物转化：将分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)B-NRRL3683菌种经过斜面培养和液体种子培养后，种子过滤分离，加入到PBS缓冲体系中，对所述植物甾醇醚化物进行发酵转化，得到发酵产物；(3)水解：将所述发酵产物用乙酸乙酯萃取，减压升温浓缩后用盐酸水解，得水解产物；(4)精制：将所述水解产物进行精制提纯，得到去氢表雄酮产品。2.根据权利要求1所述一种静息细胞转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，所述步骤(1)中甲缩醛与植物甾醇的质量比为10-40:1。3.根据权利要求1所述一种静息细胞转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，所述步骤(2)中B-NRRL3683菌种种子培养的方法包括以下步骤：(1)斜面培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，琼脂20g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；接种后，30℃培养4-5d；(2)一级种子培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；接种后，于30℃，200rpm摇床培养48h；(3)二级种子培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；将一级种子液按体积比10％接种至二级种子培养基，接种后，于30℃，200rpm摇床培养48h。(4)种子罐培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0，按上述配方配制培养基，121℃灭菌30min；将二级种子液按体积比10％接种至种子培养基，培养参数：于28-32℃，空气流量0.5-1.0vvm，搅拌速度50-500rpm，罐压0.05-0.06MPa条件下培养，培养时间14-96小时。4.根据权利要求1所述一种静息细胞转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，步骤(2)中转化培养基配方包括以质量百分比计的以下成分：植物甾醇醚化物10-100g/L，羟丙基环糊精10-400g/L，菌20-200g/L，PPE5g/L，余量为20mMPBS(pH＝8.0)。5.根据权利要求1或4所述一种静息细胞转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，所述植物甾醇醚化物粉碎至200目。6.根据权利要求1所述一种静息细胞转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的静息细胞转化方法具体为：按所述配方配制转化体系，于28-32℃，搅拌速度50-500rpm,空气流量0.5-1.0vvm，罐压0.05-0.06MPa条件下转化。7.根据权利要求1所述一种静息细胞转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，所述步骤(3)中盐酸的质量分数为5％，所用物料配比以体积计乙酸乙酯1-20份，5％盐酸1-30份；减压升温条件为-0.08MPa、45℃、5h，加入盐酸后升温至60℃，水解1-