抗TNF-α单克隆抗体的制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111153993A(43)申请公布日2020.05.15(21)申请号201911005798.8C07K1/22(2006.01)(22)申请日2019.10.22C07K1/18(2006.01)(66)本国优先权数据201811320491.22018.11.07CN(71)申请人正大天晴药业集团南京顺欣制药有限公司地址211122江苏省南京市江宁区福英路1099号（江宁高新区）申请人正大天晴药业集团股份有限公司(72)发明人谢一龙尚战强陆建胜苏贤德胡伟伟陈强陈玄刘倩倩(51)Int.Cl.C07K16/24(2006.01)C07K1/36(2006.01)C07K1/34(2006.01)权利要求书1页说明书8页附图2页(54)发明名称抗TNF-α单克隆抗体的制备方法(57)摘要本发明涉及抗TNF-α单克隆抗体的制备方法，包括亲和层析，病毒灭活，深层过滤，阴离子交换层析，阳离子交换层析等步骤。本发明通过在亲和层析淋洗过程中增加缓冲液电导率，以及在阳离子交换层析淋洗过程中改变缓冲液的pH，提高了产品的纯度，同时得到了较高的总回收率。CN111153993ACN111153993A权利要求书1/1页1.一种纯化蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：(a)亲和层析；(b)病毒灭活；(c)深层过滤；(d)阴离子交换层析；(e)阳离子交换层析。2.如权利要求1所述的方法，其中所述亲和层析的淋洗步骤包括淋洗缓冲液电导率的增加，例如先用含150mM氯化钠的50mMTris-乙酸缓冲液进行冲洗，再用含1M氯化钠的50mM乙酸钠-乙酸缓冲液进行淋洗，最后用50mM的乙酸钠-乙酸缓冲液进行淋洗，所述亲和层析还包括采用较低pH的缓冲液对目的蛋白进行洗脱。3.如权利要求1-2任一项所述的方法，其中阳离子交换层析步骤包括平衡，上样，淋洗三次，洗脱等。4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其中阳离子交换层析淋洗过程包括缓冲液pH的改变。5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述阳离子交换层析包括：1)将产品加载到阳离子交换材料中，使所述组合物处于第一pH，2)用第一淋洗缓冲液进行第一次淋洗，使所述组合物继续处于第一pH，3)用第二淋洗缓冲液进行第二次淋洗，所述第二淋洗缓冲液具有第二pH，4)用第三淋洗缓冲液进行第三次淋洗，所述第三淋洗缓冲液具有第三pH。6.如权利要求5所述的方法，其中所述第二pH比第一pH值至少高约1.5以上。7.如权利要求5-6任一项所述的方法，其中所述第三pH比第二pH值至少低约2.0以上。8.如权利要求1-5任一项所述的方法，所述方法还包括在淋洗后用电导率大于所述第一淋洗缓冲液、第二淋洗缓冲液和第三淋洗缓冲液的洗脱液洗涤目的蛋白。9.如权利要求1-8任一项所述的方法，其中所述蛋白是抗体，优选为特异结合TNF-α的单克隆抗体，更优选为阿达木单抗。10.药物组合物的制备工艺，所述工艺包括采用权利要求1-9任一项所述的方法对蛋白质进行纯化。2CN111153993A说明书1/8页抗TNF-α单克隆抗体的制备方法技术领域[0001]本发明属于蛋白质纯化领域，具体而言涉及一种抗TNF-α单克隆抗体的制备或纯化方法。背景技术[0002]肿瘤坏死因子α(TumorNecrosisFactorα，TNF-α)是一种促炎细胞因子，主要由巨噬细胞分泌，能促进淋巴细胞的浸润，加速T细胞的活化，其在正常的免疫应答中发挥抗感染和抗损伤的作用。然而，长期高水平的TNF-α与多种自身免疫疾病和炎症性疾的发生密切相关，如类风湿性关节炎、牛皮癣、克罗恩氏病、强直性脊柱炎和溃疡性结肠炎。TNF-α单克隆抗体能特异性地结合TNF-α，竞争性地阻断TNF-α与其受体结合，阻止其对免疫反应的调控及其对炎症的诱导作用，具有靶向性强、毒副作用低、高效等特点，因此在临床医疗中发挥重要的作用。目前，已有多种TNF-α单克隆抗体药物被批准用于自身免疫和炎症性疾病的治疗，包括英夫利昔单抗(infliximab)、戈利木单抗(golimumab)、阿达木单抗(adalimumab)、赛妥珠单抗(certolizumabpegol)。[0003]单克隆抗体药物通常是利用经基因工程改造的能产生目的蛋白的哺乳动物细胞表达，如CHO、BHK细胞等，以确保获得期望的折叠和糖基化，所述基因工程包括将目的基因导入到该细胞系中。哺乳动物细胞培养过程中添加包含氨基酸、盐和生长因子等多种成分的培养基，宿主细胞自身产生的宿主蛋白(HostCellProtein，HCP)和核酸等，导致细胞培养产物成分复杂；且单克隆抗体药物的分子量大、结构复杂，给制造工艺带来较大的困难。但为了确保抗体药物对人体的安全性，必须去除生产过程累