一种测定诺氟沙星的时间分辨荧光免疫试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111323400A(43)申请公布日2020.06.23(21)申请号201811541282.0(22)申请日2018.12.17(71)申请人江苏维赛科技生物发展有限公司地址212009江苏省镇江市丁卯新区国家科技园B11栋3楼(72)发明人洪霞秦悦张淑雅(51)Int.Cl.G01N21/64(2006.01)G01N33/577(2006.01)G01N33/68(2006.01)权利要求书1页说明书5页附图1页(54)发明名称一种测定诺氟沙星的时间分辨荧光免疫试剂盒(57)摘要本发明公开了一种检测诺氟沙星的时间荧光分辨荧光免疫分析试剂盒。所述检测诺氟沙星的时间分辨荧光免疫分析检测试剂盒是由多孔包被板、缓冲液、诺氟沙星标准品、诺氟沙星的抗体冻干品、铕标记的羊抗鼠抗体、洗涤液和增强液所组成。所述检测诺氟沙星的时间荧光免疫分析试剂盒的检测方法包括下列步骤：(1)免疫原的制备；(2)包被原的制备；(3)单克隆抗体的制备；(4)样品的前处理及检测。本发明检测时间短、平均回收率高、样品前处理简单、能现场操作检测，应用广泛，检测成本低，同时具有检测特异性强，批内和批间差异小、灵敏度高和操作简单快速，且特别适合于大批量样品的检测等优点。CN111323400ACN111323400A权利要求书1/1页1.一种检测诺氟沙星的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：由多孔包被板，缓冲液，诺氟沙星标准品，诺氟沙星的抗体冻干品，铕标记的羊抗鼠抗体，洗涤液和增强液所组成。2.一种根据权利要求1所述检测诺氟沙星的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，包括免疫原、包被原和单克隆抗体的制备以及样品前处理，其特征在于：(1)将诺氟沙星与牛血清白蛋白偶联，得到免疫原；(2)将诺氟沙星与卵血清蛋白偶联，得到包被原；(3)用步骤(1)的免疫原免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗诺氟沙星的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；(4)以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用ProteinG柱进行纯化，获得抗诺氟沙星的单克隆抗体(5)用步骤(2)的包被原包被固相载体；(6)将动物组织先经过酸解提取后，再过MAX柱净化，最后加入衍生试剂和催化剂进行处理，得到待测产物；(7)将步骤(6)的待检物进行测量荧光强度cps，对照标准曲线计算样品中的诺氟沙星诺氟沙星含量。3.根据权利要求1所述检测诺氟沙星的时间荧光免疫分析法试剂盒，其特征在于：所述的固相载体是多孔包被板，采用96孔的多微孔包被板作为固相载体。4.根据权利要求1所述检测诺氟沙星的时间荧光分辨免疫分析法试剂盒，其特征在于：所述的衍生试剂是丁胺。5.根据权利要求1所述检测诺氟沙星的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒，其特征在于：所述的催化剂是腈基磷酸二乙酯。6.根据权利要求1所述检测诺氟沙星的时间荧光免疫分析法试剂盒，其特征在于：所述步骤(6)和(7)具体为取包被有诺氟沙星-OVA的微孔包被板，加入50µL处理好的样品到各自的微孔中，加入50µL以缓冲液稀释的诺氟沙星抗体，25~37℃振荡0.5~1小时，洗涤液洗3+三次，加以缓冲液稀释的100µLEu-羊抗鼠抗体，25~37℃振荡0.5~1小时，洗涤液洗六次，加200µL增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，从标准曲线计算样品中的诺氟沙星含量。2CN111323400A说明书1/5页一种测定诺氟沙星的时间分辨荧光免疫试剂盒技术领域[0001]本发明属于生物检测领域，具体的说，涉及一种检测诺氟沙星的时间分辨荧光免疫分析试剂盒。背景技术[0002]诺氟沙星是氟喹诺酮类抗生素，具有下列特性：由于独特的化学结构，使其成为兽医临床药物中十分重要的抗生素。诺氟沙星对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和支原体类病原菌均具有广谱抗菌活性，在一定的浓度下对细菌支原体也具有杀菌作用，还能杀死对抗生素具有抗药力的细菌，例如抗p一乳酸菌素、氨基糖昔等。诺氟沙星因其具有独特的作用，自80年代开始就被广泛的应用于动物和鱼虾类的疾病的预防和治疗。但最近的研究发现，凡使用过诺氟沙星的动物，在一定时期内其产品都有残留，因其具有神经毒性和肾脏毒性，所以在动物食品中残留会对人类健康造成威胁和影响，欧美国家及我国均要求对其限量使用。2002年12月我国农业部公告第235号文规定在所有食品动物的肌肉、脂肪中最高残留限量为100µg/kg，在所有食品动物的肝、肾中最高残留限量为200µg/kg。因此，诺氟沙星己经列为兽药残留监控的重点。检测诺氟沙星残留量的化学方法主要有薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气一质联机(GC/MS)、液一质联机(HPLC/MS)、毛细管电泳(CE)等，由于复杂的仪器设各和繁琐的过程，不适合现场监控和大量样