一种测定孔雀石绿的时间分辨荧光免疫试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111366564A(43)申请公布日2020.07.03(21)申请号201811596055.8(22)申请日2018.12.26(71)申请人镇江华维检测技术有限公司地址212009江苏省镇江市新区丁卯经十五路99号11幢(72)发明人杜霞洪霞秦悦(51)Int.Cl.G01N21/64(2006.01)G01N33/543(2006.01)G01N33/577(2006.01)G01N33/68(2006.01)权利要求书1页说明书5页(54)发明名称一种测定孔雀石绿的时间分辨荧光免疫试剂盒(57)摘要本发明公开了一种检测孔雀石绿的时间荧光分辨荧光免疫分析试剂盒。所述检测孔雀石绿的时间分辨荧光免疫分析检测试剂盒是由多孔包被板、缓冲液、孔雀石绿标准品、孔雀石绿的抗体冻干品、铕标记的羊抗鼠抗体、洗涤液和增强液所组成。所述检测孔雀石绿的时间荧光免疫分析试剂盒的检测方法包括下列步骤：(1)免疫原的制备；(2)包被原的制备；(3)单克隆抗体的制备；(4)样品的前处理及检测。本发明检测时间短、平均回收率高、样品前处理简单、能现场操作检测，应用广泛，检测成本低，同时具有检测特异性强，批内和批间差异小、灵敏度高和操作简单快速，且特别适合于大批量样品的检测等优点。CN111366564ACN111366564A权利要求书1/1页1.一种检测孔雀石绿的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：由多孔包被板，缓冲液，孔雀石绿标准品，孔雀石绿的抗体冻干品，铕标记的羊抗鼠抗体，洗涤液和增强液所组成。2.一种根据权利要求1所述检测孔雀石绿的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，包括免疫原、包被原和单克隆抗体的制备以及样品前处理，其特征在于：(1)将孔雀石绿与牛血清白蛋白偶联，得到免疫原；(2)将孔雀石绿与卵血清蛋白偶联，得到包被原；(3)用步骤(1)的免疫原免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗孔雀石绿的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；(4)以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用ProteinG柱进行纯化，获得抗孔雀石绿的单克隆抗体(5)用步骤(2)的包被原包被固相载体；(6)将动物组织先经过酸解提取后，再过MAX柱净化，最后加入衍生试剂和催化剂进行处理，得到待测产物；(7)将步骤(6)的待检物进行测量荧光强度cps，对照标准曲线计算样品中的孔雀石绿孔雀石绿含量。3.根据权利要求1所述检测孔雀石绿的时间荧光免疫分析法试剂盒，其特征在于：所述的固相载体是多孔包被板，采用96孔的多微孔包被板作为固相载体。4.根据权利要求1所述检测孔雀石绿的时间荧光分辨免疫分析法试剂盒，其特征在于：所述的衍生试剂是丁胺。5.根据权利要求1所述检测孔雀石绿的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒，其特征在于：所述的催化剂是腈基磷酸二乙酯。6.根据权利要求1所述检测孔雀石绿的时间荧光免疫分析法试剂盒，其特征在于：所述步骤(6)和(7)具体为取包被有孔雀石绿-OVA的微孔包被板，加入50µL处理好的样品到各自的微孔中，加入50µL以缓冲液稀释的孔雀石绿抗体，25~37℃振荡0.5~1小时，洗涤液洗3+三次，加以缓冲液稀释的100µLEu-羊抗鼠抗体，25~37℃振荡0.5~1小时，洗涤液洗六次，加200µL增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，从标准曲线计算样品中的孔雀石绿含量。2CN111366564A说明书1/5页一种测定孔雀石绿的时间分辨荧光免疫试剂盒技术领域[0001]本发明属于生物检测领域，具体的说，涉及一种检测孔雀石绿孔雀石绿的时间分辨荧光免疫分析试剂盒。背景技术[0002]孔雀石绿(MG)是一种三苯甲烷类工业染料，常用于制陶、纺织、皮革、食品颜色剂和细胞化学染色剂等。也可用作驱虫剂、杀虫剂、防腐剂，是药用染料中抗菌效力较强的一类，用于预防与治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等。近年来发现孔雀石绿(MG)特别是其代谢产物无色孔雀石绿(LMG)在水产动物体内有明显的蓄积残留现象，而其化学官能团三苯甲烷是一类致癌物质，食用经MG治疗的水产品后，免疫系统和繁殖系统受到较大的影响，具体地说是一种水产品中孔雀石绿快速定性的检测方法。[0003]目前已发现可以致癌的化合物约有450余种，孔雀石绿，三苯甲烷类工业染料，是一种重要的化学致癌物，使用被其污染的水体，对人体健康有很大的威胁。测定食品及环境中孔雀石绿及其代谢物常用高效液相色谱法。采用二氧化铅衍生柱进行柱前或柱后氧化，将无色孔雀石绿氧化为孔雀石绿后进行检测"驯；或者利用HPLC一荧光检测法直接检测鱼肉组织中的无色孔雀石绿。虽然这些方法的准确度较高，但仪器昂贵、样品预处理复杂、费时、检测成本高。为了确保动物食品安全，避免孔雀石绿对水生物及人体健康的危害，有必要建立对水产