一种纳豆菌发酵菜用大豆等外品产纳豆激酶的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111454932A(43)申请公布日2020.07.28(21)申请号202010344278.6(22)申请日2020.04.27(71)申请人黑龙江大学地址150000黑龙江省哈尔滨市南岗区学府路74号申请人山东品高健康产业有限公司(72)发明人李秀凉朱玉孙庆申靳文凤(74)专利代理机构青岛高晓专利事务所(普通合伙)37104代理人张清东(51)Int.Cl.C12N9/56(2006.01)C12R1/125(2006.01)权利要求书1页说明书11页附图6页(54)发明名称一种纳豆菌发酵菜用大豆等外品产纳豆激酶的方法(57)摘要本发明涉及微生物发酵技术领域，具体地涉及一种纳豆菌发酵菜用大豆等外品产纳豆激酶的方法，包括：将配制好的纳豆菌菌液按2％接种到经挑选、清洗、蒸熟灭菌后的菜用大豆等外品中，在37℃恒温培养箱中发酵36小时，后熟18小时，盐溶离心得初提取液，硫酸铵盐析初步纯化得粗酶液，再用DEAE离子交换柱层析进一步纯化。本发明的目的是为发酵产纳豆激酶提供一种新的思路，以及为公司等外品的处理问题提供解决方案。最佳发酵工艺下生产的纳豆激酶活力可达到2326.60IU/g；经SDS-PAGE电泳试验验证，所提取的纳豆激酶的分子质量为25～35kDa之间，回收率和纯化倍数分别为4.9％和11.2倍；本发明为纳豆激酶的生产及后续的体内试验提供了理论基础。CN111454932ACN111454932A权利要求书1/1页1.一种纳豆菌发酵菜用大豆等外品产纳豆激酶的方法，其特征在于：包括：(1)原料处理：菜用大豆等外品经挑选、冲洗后称重，121℃高压蒸汽灭菌20min蒸熟；(2)接种：将纳豆枯草芽孢杆菌菌液按照1～4％接种到菜用大豆等外品中；(3)发酵：将倒入菌液的菜用大豆等外品在35～41℃条件下，恒温发酵12～48小时；(4)后熟：发酵完成后使其在4℃条件下，静置放置6～24小时，得纳豆产品；(5)提取：盐溶后离心，取上清液，即为提取液；(6)分离纯化：硫酸铵盐析初步纯化，柱层析进一步纯化；(7)干燥，得冻干粉。2.根据权利要求1所述的纳豆菌发酵菜用大豆等外品产纳豆激酶的方法，其特征在于：所述步骤(1)蒸熟后保持温度在45-55℃。3.根据权利要求1所述的纳豆菌发酵菜用大豆等外品产纳豆激酶的方法，其特征在于：所述步骤(2)的接种量为2％。4.根据权利要求1所述的纳豆菌发酵菜用大豆等外品产纳豆激酶的方法，其特征在于：所述步骤(2)豆子温度保持在48-52℃时倒入菌液。5.根据权利要求1所述的纳豆菌发酵菜用大豆等外品产纳豆激酶的方法，其特征在于：所述步骤(3)的发酵温度为37℃，发酵时间为36小时。6.根据权利要求1所述的纳豆菌发酵菜用大豆等外品产纳豆激酶的方法，其特征在于：所述步骤(4)的后熟时间为18小时。7.根据权利要求1所述的纳豆菌发酵菜用大豆等外品产纳豆激酶的方法，其特征在于：所述步骤(5)的具体过程为：将纳豆产品冻干打粉后称重，加入10倍体积0.9％的生理盐水，在4℃下盐溶4h，10000r/min、4℃下离心15min，取上清，医用脱脂棉过滤除去脂肪组织及其他不溶物，得初提取液。8.根据权利要求1所述的纳豆菌发酵菜用大豆等外品产纳豆激酶的方法，其特征在于：所述步骤(6)的盐析，采用20％～60％硫酸铵饱和度，柱层析使用DEAE阴离子交换柱层析。9.根据权利要求1所述的纳豆菌发酵菜用大豆等外品产纳豆激酶的方法，其特征在于：所述步骤(7)的干燥为真空冷冻干燥。2CN111454932A说明书1/11页一种纳豆菌发酵菜用大豆等外品产纳豆激酶的方法技术领域[0001]本发明涉及微生物发酵技术领域，具体地涉及一种纳豆菌发酵菜用大豆等外品产纳豆激酶的方法。背景技术[0002]纳豆作为一种具有两千年历史的传统食物，具有防止骨质疏松和促凝血、抗致病菌、延缓衰老、防癌抗癌、调整肠道功能等多种医疗保健功效。其中的主要活性成分—纳豆激酶更是以其良好的溶栓特性和安全性引起了广泛重视。纳豆激酶溶栓性好，来源广泛，安全无毒，且分子量小，易被人体吸收，作为一种微生物代谢产物有实现大规模生产的可能性，具有广泛的开发应用前景。目前关于纳豆产品的研究主要是基于大豆为发酵原料，生产包括纳豆激酶在内的系列产品，也有用木豆、红豆、鹰嘴豆等作为生产原料研究纳豆激酶生产的，但是以菜用大豆等外品作为发酵原料，生产纳豆激酶未见报道，因此，以菜用大豆等外品为基质，生产纳豆激酶及包括异黄酮类化合物在内的各种产品的生产条件不确定。因此，有必要设计一种纳豆菌发酵菜用大豆等外品产纳豆激酶的方法，以获得相对产量较高的纳豆激酶产品，同时解决了企业等外品的处理问题。发明内容[0003]本发明的目的在于